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蜱传脑炎病毒(TBEV)是一种重要的蜱传病毒,与黄热病病毒(YFV)、登革病毒(DENV)、寨卡病毒(ZIKV)等同属黄病毒科黄病毒属,是正链RNA病毒。感染TBEV可能会引发脑膜炎,脑炎和脑膜脑炎,严重可导致终身神经系统并发症,这些症状统称为蜱传脑炎(TBE)。自1937年前苏联科学家在苏联上报该病以后,陆续在欧洲、西伯利亚、俄罗斯、中国北部和日本等至少34个国家都发现了这种病。TBE每年的发病率仍在上升,而且相比其他蚊媒传播的黄病毒,对TBEV等蜱传病毒的了解很少。因此研究TBEV与宿主细胞的相互作用,分子生物学等特性仍然十分有必要。报告病毒是监测病毒、研究病毒毒力、抗病毒药物筛选中经常用到的有力工具,然而目前还未见有关TBEV报告病毒的相关报道。本文主要进行了以下两方面的工作:TBEV Nluc报告病毒载体的构建及活性检测;TBEV miRFP670nano报告病毒的构建及活性检测。一、TBEV Nluc报告病毒载体的构建及活性检测Nluc基因是荧光素酶领域新开发出的一个基因,该基因有分子量小、灵敏度高等特点。构建含有Nluc报告基因的TBEV报告病毒,报告基因的插入位点在TBEV衣壳蛋白第38个氨基酸的后面。采用两种克隆策略,一种是在报告基因后面连接一段2A序列,方便报告基因的切割。另一种策略是在报告基因的前后都插入2A序列。在Nluc报告病毒载体构建完成后,检测了Nluc报告病毒的荧光素酶活性以及病毒蛋白,并对Nluc报告病毒进行病毒生长曲线测定。结果表明成功构建出TBEV的Nluc报告病毒,生长曲线趋势与TBEV感染性克隆一致。二、TBEV miRFP670nano报告病毒载体的构建及活性检测试验选用的另一种报告基因是miRFP670nano,miRFP670nano是最近开发出的一种近红外蛋白,可以结合哺乳动物细胞中的内源性胆绿素而产生荧光。在构建含有miRFP670nano的TBEV报告病毒载体时,在报告基因前后都加入了2A序列。在miRFP670nano报告病毒载体构建完后,检测了报告病毒在病毒RNA和蛋白水平的表达,同时检测了报告病毒的生长曲线,结果表明成功构建出了TBEV的miRFP670nano报告病毒,生长曲线趋势与TBEV感染性克隆一致。