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目的:本文基于卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌H37Ra株感染人单核巨噬细胞系THP-1,外泌体分离、鉴定,转录组高通量测序,和生物信息学分析,选择差异表达的miRNA,并经初步临床评估,以期望找到潜在的结核病新型标志物。方法:(1)分别用BCG和H37Ra菌株分别对THP-1细胞系进行感染,以未感染作为对照,培养72h后超速离心法提取细胞培养上清的外泌体,western blotting和透射电子显微镜鉴定外泌体。(2)提取外泌体总RNA后,经新一代Illumina高通量测序,RNA-seq数据分析,多种生物信息学方法对测序结果进行差异表达分析,靶基因预测,GO分析和KEGG信号通路分析。(3)选择肺结核患者血清,健康人血清,用试剂盒提取其血清外泌体和miRNA,并用qPCR去验证差异表达的miRNA在临床样本中的表达情况。结果:(1)THP-1细胞在被细菌感染后出现伪足,呈巨噬细胞形态,感染成功;Western blotting表明沉淀同时含有TSG101和CD9这两种外泌体表面蛋白,透射电子显微镜表明沉淀直径在30-150nm范围内且为杯状双层膜结构,结果表明沉淀为外泌体。(2)BCG感染组外泌体RNA浓度为71.74 ng/μL,H37Ra感染组外泌体RNA浓度为68.17 ng/μL,Control组外泌体RNA浓度为62.83 ng/μL;Agilent 2100Bioanalyzer仪器检测,表明文库构建较好,可进行测序;将BCG感染组外泌体miRNA和H37Ra感染组外泌体miRNA分别与对照组外泌体miRNA做对比进行差异表达分析,以|logFC|>1为规则筛选后得到共有hsa-miR-186-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-493-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-335-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-222-3p等12个显著上调和hsa-miR-548o-3p、hsa-miR-126-5p等2个显著下调的miRNA,根据FC值及Reads值综合分析,最终选择miR-142-3p进行临床标本验证;每个差异表达miRNA用Targetscan,miRwalk,miRDB和PicTar四个软件预测靶基因取其交集,最终所有的差异miRNA的靶基因共有1446个;对靶基因进行GO分析和KEGG信号通路分析。(3)初步研究显示miR-142-3p在肺结核病人和健康人中的表达有显著性差异。结论:(1)建立了基于卡介苗(BCG)和结核分支杆菌H37Ra株感染THP-1细胞系的外泌体分离和鉴定技术。(2)通过RNA文库成功构建,RNA-seq数据分析,显示BCG感染组,H37Ra感染组与对照组存在差异表达miRNA,并解析了这些miRNA与结核免疫信号通路的关联。(3)初步临床评估显示了外泌体中miR-142-3p在活动性肺结核诊断中的潜在价值。本研究揭示了结核感染的外泌体中存在与结核免疫信号通路相关联的miRNA,其中miR-142-3p具有作为结核诊断生物标志物的潜在应用前景。研究结果为解析当前结核病发病机制研究面临的困境和开发新的结核病快速诊断技术提供新视角。