茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)菌株ORS571可与宿主植物毛萼田菁(Sesbania rostrata)共生形成根瘤或茎瘤而共生固氮,也可在自生状态下固氮生存。环二鸟苷酸(cyclic diguanylate or cyclic di-guanosine monophosphate,c-di-GMP)作为细菌中普遍存在的第二信使,在细胞信号转导中起到十分重要的作用。c-di-GMP能够调节各种生理功能的前提是二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)能接受到来自感应结构域如PAS、GAF、REC等的信号的传递,从而启动或关闭相关基因的转录和翻译,调节细胞内c-di-GMP水平的变化。本文应用生物信息学工具分析编码二鸟苷酸环化酶(DGC)的基因,从中选择5个含有不同感应结构域的环化酶基因(包括AZC-2411、AZC-2412、AZC-2512、AZC-3566和AZC-3914)进行深入研究,以期解析c-di-GMP在A.caulinodans strain ORS571中的调控作用,主要研究内容和结果如下:(1)生物信息学分析显示,5个候选DGC蛋白都具有GGDEF结构域,推测5个候选DGC蛋白可能具有催化生成c-di-GMP的二鸟苷酸环化酶活性。采用基于cre-loxp重组酶系统的根瘤菌基因敲除体系和采用三亲接合技术,成功地构建了这5个候选DGC蛋白各自的基因敲除突变株,即ΔAZC-2411、ΔAZC-2412、ΔAZC-2512、ΔAZC-3566和ΔAZC-3914。(2)为阐明所选基因的功能,本文对上述突变株的表型进行鉴定。在液体培养基中测试生长状况,绘制各突变株的生长曲线。利用液相色谱串联质谱法测定各突变株体内c-di-GMP含量。在L3半固体平板上检测趋化能力,观察各突变株趋化圈的大小。在有氧条件下进行絮凝实验,测定各突变株的絮凝量。利用结晶紫染色法测定生物膜,观察各突变株的生物膜产量变化。利用蒽酮-浓硫酸氧化法测定胞外多糖产量,检测各突变株胞外多糖生产水平。通过进行竞争性结瘤实验,探究各突变株与宿主植物互作能力。实验结果表明,5个突变株的生长与野生型几乎无差异。与野生型相比,除3株突变体(AZC-2411,AZC-3566和AZC-3914)无显著差异外,突变株ΔAZC-2412和ΔAZC-2512的c-di-GMP含量、絮凝量和胞外多糖产量均减低,然而趋化能力增强。此外,无论是在L3-N或L3+N培养基中,突变株ΔAZC-2412和ΔAZC-2512形成的生物膜量均低于野生型。竞争结瘤实验显示,突变株ΔAZC-2412和ΔAZC-2512的结瘤能力亦显著降低。研究表明环二鸟苷酸合成酶基因AZC-2412和AZC-2512均能通过控制c-di-GMP水平,进而调控A.caulinodans菌株ORS571的生理生化(胞外多糖、细菌运动、生物膜和细胞絮凝)及与宿主植物互作(结瘤固氮)等生物学特性。这些发现为全面解析细菌第二信使c-di-GMP介导的调控机制提供了新知识,也为优异固氮菌株A.caulinodans ORS571的应用提供了科学参考。