本研究采用1株四川本地鸭场分离鉴定的DHAV-C毒株人工感染SPF雏鸭，通过病理剖检、组织切片H E染色、免疫酶组织化学染色和细胞凋亡检测等对该毒株的致病性进行了较为系统的研究，阐明了该毒株的致病性；同时对14株DHAV-C四川分离株的VP1基因进行了克隆测序及分析，揭示了VP1基因的遗传多样性；并对VP1基因进行了原核表达，为进一步研究DHAV-C亚单位疫苗和DVH快速诊断技术奠定了基础。主要取得如下成果：1确定了DHAV-C对SPF雏鸭的致病性及病理学特性本试验采用颈部皮下注射DHAV-C病毒液感染3日龄SPF雏鸭，成功建立了DHAV-C病理模型。感染后不同时间点随机选取感染鸭，剖检并采取各组织制备病理切片，以H E染色、免疫酶组织化学染色和细胞凋亡检测等方法研究DHAV-C的致病特性。结果感染鸭剖检发现DHAV-C主要侵害肝脏、脾脏、法氏囊、肾脏、胸腺、胰脏等实质器官和免疫器官，感染早期以组织器官的轻微出血、肿大为主，随着感染时间的延长，进一步表现为组织器官的大面积出血和肿大加剧；组织病理学观察发现DHAV-C感染后，雏鸭的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、小肠、胸腺、胰脏、大脑、法氏囊等均发生了不同程度的病变，其中以肝脏、脾脏、法氏囊、胸腺、肾脏、胰脏等器官的组织病变最为明显，这与病理剖检结果相符；组织病变最早于感染1h后在肝脏和脾脏中出现，18h后大部分器官组织均发生不同程度的病变，且DHAV-C进入机体后，能很快造成肝脏及脾脏和法氏囊等器官的损伤坏死，尤其是肝脏的大面积出血与坏死，使得机体功能紊乱，这与雏鸭感染后18h出现临床症状，26h后出现神经症状及32h后出现死亡密切相关。免疫组化染色在DHAV-C感染雏鸭的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、胸腺、法氏囊、胰腺、小肠和大脑等10个组织器官中均检出病毒抗原。DHAV-C抗原最早于感染后1h的雏鸭肝脏、脾脏和法氏囊中检出；6h后心脏、肾脏、小肠和胸腺中检出；胰脏和肺脏于12h后检出；大脑在24h后检出，但抗原量相对较少。除大脑组织外，其余组织器官的病毒抗原检出量随感染时间的持续进一步增多。各组织中的病毒抗原含量以肝脏、脾脏和肾脏最高，胰脏、法氏囊、胸腺、小肠、心脏次之，肺脏和大脑中检出最低，且大脑检出量极低。病毒抗原定位于被感染细胞的胞质中。DHAV-C感染雏鸭的10个组织器官中均检测到不同程度的细胞凋亡，对照组雏鸭组织未检出或极少检出凋亡的细胞，凋亡荧光检测结果与DAB显色结果相符，因此可推断DHAV-C可直接或间接诱导雏鸭组织细胞的凋亡。组织细胞的凋亡于感染后1h最早在雏鸭免疫器官脾脏、法氏囊和胸腺中检出，随感染时间的延长，各组织器官中均检出大量凋亡的细胞，推测DHAV-C诱导的细胞凋亡在感染雏鸭发病及致组织细胞病变的过程中起着重要的作用。2揭示了DHAV-C分离株VP1基因变异及其编码蛋白的抗原表位差异本试验克隆了14株DHAV-C分离株VP1基因，并对VP1基因变异及其编码蛋白的抗原表位进行了分析。结果表明：14株DHAV-C分离株确为同一基因型。其中四川华阳地区分离的6株DHAV-C的VP1基因与我国黑龙江分离株Du/CH/LJS/090905同属一支，3株四川邛崃地区分离株与北京分离株C-GY及福建分离株FJ01同属一支，而4株四川郫县分离株与1株四川邛崃分离株处于独立的小分支，与其它毒株VP1基因存在着一定的差异，有明显的遗传距离，这些毒株可能是四川地区特有的流行毒株。因此，四川分离株可能由于引种等原因从全国不同地区进入四川境内，阐明了这些分离株的可能来源。测序的14个分离株VP1蛋白氨基酸序列的抗原指数均较高，且各毒株之间的抗原指数差异极小，与DHAV-A及DHAV-B VP1之间的抗原指数差异集中在57~69、97~149和182~223位3个区域，为DHAV-C抗原位点的高变区，针对这些高变区，可以设计DHAV-C的多表位疫苗。本研究为进一步研究DHAV-C VP1基因变异位点对其致病力的影响，以及为DHAV诊断抗原的制备和新型疫苗的研究提供了理论基础。3成功表达了DHAV-C VP1蛋白本试验成功构建了原核表达重组质粒pET-32a(+)-VP1，并在E.coli Rosetta(DE3)中表达出分子量约为47KDa的重组VP1蛋白，Western-blot分析结果显示，表达的融合蛋白能被兔抗DHAV-C阳性血清识别，不与健康未免疫DHAV-C的兔血清反应，证明该蛋白具有良好的反应原性。重组VP1蛋白在体外大量稳定的表达，为其作为诊断抗原建立血清学诊断方法、进一步开展DHAV的免疫学和DHAV致病机理研究以及DHAV新型疫苗的研究奠定了基础。