【摘 要】
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目的:1.观察高糖髙脂对成骨细胞线粒体功能的影响及调控TLR4的表达对其的影响。2.探讨TLR4对糖脂毒性成骨细胞NLRP3、MAVS蛋白表达的影响。方法:1.实验设计:本实验选用小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14（MC3T3-E1 subclone 14）作为研究对象。实验将分为两部分:第一部分高糖髙脂对成骨细胞线粒体功能的影响及调控TLR4的表达对其的影响。第二部分探讨TLR4对糖脂毒性成骨细胞NLR
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目的:1.观察高糖髙脂对成骨细胞线粒体功能的影响及调控TLR4的表达对其的影响。2.探讨TLR4对糖脂毒性成骨细胞NLRP3、MAVS蛋白表达的影响。方法:1.实验设计:本实验选用小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14（MC3T3-E1 subclone 14）作为研究对象。实验将分为两部分:第一部分高糖髙脂对成骨细胞线粒体功能的影响及调控TLR4的表达对其的影响。第二部分探讨TLR4对糖脂毒性成骨细胞NLRP3、MAVS蛋白表达的影响。2.成骨诱导模型的评估:成骨细胞用成骨诱导培养基培养14天后,用茜素红染液染色,在显微镜下能够看到成骨细胞分泌在胞外的矿化结节。3.慢病毒转染模型的建立:将含Vector、TLR4-siRNA、TLR4-OE的慢病毒用增强感染液稀释至1×10~8TU/ml,用含慢病毒载体的完全培养基分别感染成骨细胞,孵育12h,更换新鲜完全培养基,用蛋白印迹分析TLR4的表达。4.成骨细胞线粒体功能检测:用JC-1染色法和ATP检测试剂盒,检测高糖髙脂干预及调控TLR4的表达对成骨细胞线粒体膜电位和ATP含量的影响。5.成骨分化蛋白及凋亡蛋白检测:运用ELISA法检测成骨分化蛋白ALP、OCN的表达,Western blot检测成骨细胞RUNX2、Bcl-2和Bax蛋白的表达量。6.信号蛋白检测:运用Western Blot检测高糖髙脂干预对TLR4、NLRP3、MAVS蛋白表达的影响,以及调控TLR4的表达对NLRP3、MAVS蛋白表达的影响。7.蛋白质互作:运用免疫荧光共定位和免疫共沉淀探讨抑制TLR4活性对高糖髙脂调节NLRP3-MAVS表达的影响。结果:1.高糖髙脂干预对成骨细胞线粒体功能及分化功能的影响。JC-1染色结果显示,与Control组比,HG+PA组成骨细胞线粒体膜电位下降,ATP含量下降,Western Blot结果显示,促凋亡蛋白Bax表达量增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达量减少,成骨分化蛋白（ALP、OCN、RUNX2）表达量下降（P<0.05）。结果提示:高糖髙脂干预导致成骨细胞线粒体功能障碍,促进成骨细胞凋亡,抑制成骨分化。2.调控TLR4的表达对糖脂毒性成骨细胞线粒体功能及成骨分化的影响。与HG+PA组比,HG+PA+TLR4-siRNA组成骨细胞成骨分化蛋白（ALP、OCN、RUNX2）表达量增加,成骨细胞线粒体膜电位和ATP含量增加,促凋亡蛋白Bax表达下降,抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加（P<0.05）;而HG+PA+TLR4-OE组成骨分化蛋白（ALP、OCN、RUNX2）表达量显著下降,成骨细胞线粒体膜电位和ATP含量显著下降,促凋亡蛋白Bax表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降（P<0.05）。结果提示:调控TLR4表达水平可以影响糖脂毒性导致的成骨细胞线粒体功能障碍及成骨分化障碍的影响。3.调控TLR4的表达对糖脂毒性成骨细胞NLRP3、MAVS蛋白表达的作用。高糖髙脂干预可增加成骨细胞慢性炎症信号蛋白（TLR4、NLRP3、MAVS）的表达。沉默TLR4可抑制高糖髙脂诱导的NLRP3、MAVS蛋白表达（P<0.05）;而过表达TLR4可协同高糖髙脂导致的NLRP3、MAVS蛋白表达增加（P<0.05）。结果提示:调控TLR4表达水平能够影响糖脂毒性对成骨细胞NLRP3、MAVS蛋白的调节。4.抑制TLR4活性对高糖髙脂调节NLRP3-MAVS表达的影响。激光共聚焦显微镜扫描显示,与Control组比,HG+PA组成骨细胞质内NLRP3、MAVS荧光强度增加;与HG+PA组比,TLR4抑制剂（CLI-095）组成骨细胞质内NLRP3、MAVS荧光强度减弱。进一步的免疫共沉淀显示,在未加入NLRP3抗体实验组,未能检测出MAVS蛋白,而在加入NLRP3抗体实验组,检测出MAVS蛋白,与Control组比,HG+PA组MAVS蛋白增加,与HG+PA组比,TLR4抑制剂（CLI-095）组MAVS蛋白减少。结果提示:NLRP3与MAVS存在相互作用,抑制TLR4活性降低糖脂毒性成骨细胞NLRP3-MAVS的表达。结论:TLR4可介导高糖髙脂导致的成骨细胞成骨分化障碍和线粒体功能障碍,TLR4的上述介导作用可能与调节NLRP3-MAVS两者互作有关。
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