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Rab蛋白属于Ras蛋白超家族的小G蛋白(smallG-proteinorsmallGTPase),分子量大多在22-25kDa之间。Rab蛋白作为真核细胞中各细胞器之间囊泡运输的分子开关,在囊泡运输的不同阶段调节囊泡特定的运输途径。
本实验通过对已知的玉米苗期水分胁迫诱导表达cDNA文库进行筛选,获得一个玉米小GTP结合蛋白(smallGTP-bindingprotein,SGP)的相关序列,序列测定后以该cDNA序列为基础进行了电子延伸,根据电子延伸的结果设计引物,利用RT-PCR方法获得了一个玉米(Zeamays)中尚未鉴定的cDNA克隆Zmrab6,编码框长627bp,编码208个氨基酸的蛋白质。它与水稻(Oryzasativa)的GTP-bindingproteinRab6和拟南芥(Arabidopsisthaliana)的putativesmallGTP-bindingprotein(序列登录号分别是NP912248.1和AAM65455.1)在蛋白质水平上有着高度同源性(氨基酸序列ID值分别大于98%和94%),同属小G蛋白家族的Rab亚族。
Sourthern吸印/杂交表明Zmrab6在玉米基因组中可能是以两个拷贝存在,Northern吸印/杂交结果表明干旱、ABA、PEG等逆境都诱导了Zmrab6表达量增加。因此认为Zmrab6在干旱、ABA等逆境胁迫中起到了某些作用。
将Zmrab6基因的编码序列按正确读码框重组到具有六个组氨酸尾(His-Tag)融合标签的pET-30a(+)表达载体中,转化大肠杆菌,获得了稳定表达目标融合蛋白的菌株,经Ni-NTA琼脂胶柱纯化,获得了纯化的目标融合蛋白。GTP结合试验表明,在原核细胞中表达出的融合蛋白具有体外结合GTP的能力。
为了进一步研究该基因的功能,构建了两个表达载体(过量表达、RNAi干扰)并将其分别转化拟南芥。对转基因拟南芥T3、T4代纯合体株系进行表型观察,发现转正义载体的拟南芥明显比野生型拟南芥生长缓慢,其开花、抽苔、结荚分别比野生型晚约5天。