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microRNA(miRNA)与small interfering RNA(siRNA)是真核生物中长度接近，加工途径类似，并且都与Ago等蛋白质形成RISC并发挥功能的两类小RNA。其中，siRNA是真核生物中非常保守的一种转录后基因调控机制—RNA干扰（RNA interference，RNAi）的核心分子，在细胞内siRNA通过与靶标mRNA完全互补配对而引起该mRNA的切割降解。哺乳动物中，siRNA可以通过RNA聚合酶Ⅲ类启动子(比如H1、U6)转录出的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)加工产生，但随着RNAi的广泛应用，它的很多副作用逐渐显现出来。首先，siRNA可以通过类似miRNA的作用方式抑制与其部分互补配对的mRNA的表达，从而产生脱靶作用。其次，大量表达的shRNA会通过竞争细胞内源miRNA发生相关的蛋白因子（比如exportin-5、Dicer、Ago等）而降低miRNA的表达，导致miRNA靶基因的去抑制。我们通过对传统shRNA的结构研究发现shRNA根据其双链区长度可以分为三种:双链区长度大于20 bp的shRNA加工依赖于Dicer蛋白的切割;双链区长度为16 bp-18 bp的shRNA加工依赖于Ago2蛋白的切割;双链区长度为19 bp-20 bp的shRNA虽然可以被Dicer或Ago2结合但不能被两种途径有效加工。在此基础上，我们发明了一种新型的siRNA前体—single-stranded Ago2-processed interfering RNA(saiRNA)，其双链区长度为16 bp-18 bp且加工产生成熟的siRNA依赖于Ago2蛋白。在saiRNA3末端加上丁型肝炎病毒(Hepatitis Delta Virus，HDV)核酶可以使产生的saiRNA前体3末端悬垂比较短，从而促进其与Ago2蛋白的结合能力，进一步提高了其对靶基因的抑制效率。由于saiRNA只能被Ago2结合并加工，其成熟产物不会进入Agol、Ago3以及Ago4，从而避免了这些非切割活性的Ago蛋白带来的脱靶作用，另外saiRNA的特殊加工方式使其不会产生passenger strand，也就消除了该链带来的脱靶作用。在对靶基因产生同样抑制效率的情况下，saiRNA的表达量远低于传统的shRNA，即saiRNA的单位分子抑制效率很高，从而减少了其对内源 miRNA表达的影响，这些优点都使HDV核酶增强的saiRNA成为一种高效低毒的新型RNAi工具。 miRNA是一类真核细胞内源编码并加工产生的长度约22个核苷酸的非编码小RNA。动物中大多数miRNA基因首先由RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)转录产生长的miRNA初级前体—pri-miRNA，其在细胞核内被Drohsa/DGCR8复合物识别并切割产生茎环结构的miRNA前体—pre-miRNA，被exportin-5运输到核外后，pre-miRNA在Dicer/TRBP等蛋白作用下被进一步切割加工并在RISC协助下产生成熟的miRNA。RISC通过miRNA与靶标mRNA的部分互补配对而抑制该mRNA的翻译和/或促进该mRNA的降解。虽然对miRNA主要加工途径和结构特征已有较多研究，但仍存在许多关键的问题有待阐明，我们研究了末端环、中间双链区以及底部旁侧区等序列和结构对pri-miRNA加工及抑制效率的影响，发现pri-miRNA中末端环到底部单链区之间的双链区长度对其加工成pre-miRNA具有重要影响。另外我们也发现miRNA前体可以被改造成基于RNA聚合酶Ⅱ启动子的siRNA表达载体，从而实现组织特异性或可诱导的RNAi。