背景:骨缺损(Bone defects)是骨科最常见的病之一,其在临床上有较高的发病率,并且具有治愈率低,并发症多等特点。在骨缺损的修复治疗当中炎症、细胞募集、血管生成与骨生成是修复成功与否的四个关键步骤,如何有效且精确的调控四个步骤成为骨修复相关研究中的关键。在上述四个关键过程当中,充足的血管生成是骨修复的前提条件,足够的血流不但能够保证在骨修复过程中充足的氧气与营养,带走代谢废物,也能为缺损部位营造理想的微环境。相反,大量研究表明缓慢且不充足的血管再生会阻碍骨修复。因此,解决骨修复问题关键是要解决缺损部位血管化问题。而近几年研究发现内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)在促进骨修复的血管化问题中发挥重要作用。这是一种来源于骨髓和血管中的细胞,在骨缺损发生以后能够被募集到损伤部位进行血管修复工作。这种祖细胞又可以分为早期内皮祖细胞与晚期内皮祖细胞。早期内皮祖细胞通过分泌各种血管生成相关因子,例如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),血小板来源生长因子(platelet-derived growth factor)和胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor)等等。晚期内皮祖细胞对血管生成有着更加重要的作用,相比早期内皮祖细胞,晚期内皮祖细胞具有高增殖性,能够分化为内皮细胞来形成新生血管。尽管EPCs细胞在血管再生中占据着重要的位置,但是在利用其用于治疗时往往受限于它细胞数量少、迁移能力差等因素。考虑到血管再生在组织工程骨与骨修复中占据着重要部位,越来越多研究致力于增强EPCs的内源性募集来促进血管再生。除了血管修复以外,治疗效果最终取决于是否能够生成足够且成熟致密的骨组织,在骨生成的过程当中,成骨相关细胞的成骨过程与破骨细胞的骨吸收过程保持着精妙的平衡。干/祖细胞能够被募集到骨缺损部位成骨或者成软骨,并且参与骨组织的形成。通常来说骨的形成过程一般分为两类:膜内成骨,软骨内成骨。在膜内成骨的过程中,未分化的骨前体细胞与MSC细胞增殖随后直接分化成为骨细胞,这个过程能够导致坚硬的骨痂形成。相反,在软骨内成骨当中,骨组织形成之前MSC细胞分化为软骨细胞并分泌软骨基质。不管在哪种过程当中,破骨细胞也同样会被募集到缺损部位,吸收多余或者坏死的骨质,为成骨营造良好的微环境。但是由于缺损骨周围常常处于炎症环境,这会造成破骨细胞的过渡活跃,最终导致过量的骨吸收,使得新生骨密度不够,或者修复失败。如何调节骨生成与骨吸收之间的微妙平衡也非常重要。成骨相关细胞因其分化周期长,种类多,机制复杂等原因,成为难以调控的环节;而破骨细胞是骨细胞中唯一具有骨吸收功能的细胞,并且其分化周期短,使得其成为这个过程中相对比较好调控的细胞,有效、精确的调控破骨细胞成熟分化也能够维持骨生成-吸收之间的精妙平衡。仿生多肽是一类根据序列不同而被设计出来的一类多肽,这一类多肽往往是细胞某个膜蛋白的特殊激动剂,或者具有特定功能,例如增加细胞粘附性,促进细胞分化等等。目前,仿生多肽因其免疫反应低,价格便宜,生物功能效率高等优势在各个领域的疾病治疗中都被涉及,并且越来越多的骨材料方面的研究都以仿生多肽作为重点关注对象。WKYMVm是一种仿生多肽,它具有促进细胞增殖、分化的重要作用。之前有研究证明WKYVMm可以通过募集EPCs到缺血部位,以此来治疗动物肢体的缺血模型。但是其在骨缺损中是否能够促进血管新生与调节骨再生平衡还是未知,因此我们预测:在骨缺损中WKYMVm能够内源性募集EPCs进行血管修复。并且WKYMVm是FPR2受体的强烈激动剂,实验证明其他FPR2激动剂能够有效抑制破骨细胞分化,所以我们进一步推测:WKYMVm具有抑制破骨细胞分化作用,从而更进一步营造有利于骨修复的环境。YIGSR是一种促进细胞粘附的仿生多肽,经常应用于骨组织工程当中增加骨材料对组织细胞的粘附性。在以往的研究中,YIGSR除了能够增加对细胞的粘附性,还具有与其他生物多肽联用达到更好效果的特点,例如其与RGD联用,与单独使用RGD比较起来,两种多肽联用更能促进微血管内皮细胞的募集与归巢。因此,我们提出假说:YIGSR与WKYMVm两种多肽联用能够更好地促进EPCs的内源性募集与血管再生能力,有效的对缺损部位的血管进行再生,从而达到促进缺损部位的骨修复目的。本研究首先体外研究了WKYMVm与YIGSR单独使用对EPCs血管生成作用与迁移作用的影响,其次研究了两种多肽联用对EPCs血管生成与迁移作用的影响以及相关机制,并且证明了WKYMVm能够抑制破骨细胞的分化成熟,最后在骨缺损动物模型中进行研究来探讨其体内发挥的作用。主要研究内容及方法:1.体外分离、培养、鉴定原代EPCs细胞。2.体外使用CCK-8检测WKYMVm与YIGSR对EPCs细胞的增殖影响。3.体外利用Transwell与划痕实验,检测WKYMVm与YIGSR分别使用与联用对EPCs细胞迁移的影响。4.体外采用基质胶血管生成实验,检测WKYMVm与YIGSR分别使用与联用对EPCs体外管腔形成影响。5.利用Western blot与qRT-PCR检测了WKYMVm与YIGSR分别使用与联用对EPCs表达分泌VEGF-A与CXCR4的影响,以及是否通过FPR2/PI3K/AKT/VEGF-A通路来发挥作用。6.体外利用Trap染色,Western blot,PCR,骨吸收实验等,研究WKYMVm对破骨细胞分化以及骨吸收功能的影响。7.建立大鼠股骨缺损模型以验证WKYMVm与YIGSR在体内的促血管再生和促骨愈合作用。结果:1.成功分离,纯化,扩增并鉴定大鼠EPCs细胞。2.CCK-8实验证明了WKYMVm与YIGSR的浓度处于0,0.01,0.1,1,10μM时,对EPCs细胞增殖无影响。3.体外管腔形成实验显示WKYMVm在0.01,0.1,1μM时,对EPCs管腔形成具有浓度依赖性的正向影响,但是在浓度1μM以上效果不随浓度增加而增加,YIGSR在0.1μM以下对EPCs作用不明显,0.1μM以上对EPCs管腔形成呈现出抑制作用,两种多肽在联用以后比单独使用促进EPCs管腔形成的效果明显,并且以W肽在1μM,Y肽在0.1μM时联用效果最佳。4.Transwell与划痕实验显示,WKYMVm与YIGSR联用后使得EPCs迁移能力增加,且效果优于单个多肽使用。5.WKYMVm与YIGSR能够使得EPCs中血管生成相关因子表达显著增高。6.WKYMVm与YIGSR联用通过FPR2/PI3K/AKT/VEGF-A通路促血管形生成。7.WKYMVm具有抑制破骨细胞分化并且抑制破骨吸收功能的作用。8.动物实验中,WKYMVm与YIGSR联用能够内源性募集EPCs并最终促进骨修复上具有重要作用。结论:1.WKYMVm与YIGSR联用能够通过FPR2/PI3K/AKT/VEGF-A通路显著的促进EPCs细胞的血管形成。2.WKYMVm体外能够有效抑制破骨细胞生成以及破骨细胞吸收功能。3.体内联用WKYMVm与YIGS能够内源性募集EPCs并可促进大鼠股骨缺损的修复。