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研究背景： 结肠直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是最为常见的消化道恶性肿瘤，近几年随着生活水平的不断提高，CRC的发病率逐年攀升，每年有近百万新病例被确诊，多数病例在中晚期阶段才被诊断，预后不佳，死亡率高。CRC的早期症状不典型，其早期发现可以显著改善不良预后，降低CRC的死亡率，在临床上具有良好的使用价值。 目前临床上常用的筛查CRC的方式主要包括电子结直肠镜和大便潜血试验（fecal occult blood test，FOBT），分别因其是侵入性检查或阳性检出率低等缺点而限制了在CRC筛查上的广泛应用。近年来DNA甲基化检测已成为CRC早期诊断的热点，很多指南已明确指出甲基化检测可作为早期CRC筛查的方法。目前，血浆Septin9甲基化试剂盒已广泛用于临床，其对CRC的检出率和特异性均明显优于FOBT检测。由于肠粘膜表面肿瘤细胞持续脱落，所以CRC患者粪便样本可用于DNA甲基化筛查。大量数据表明，粪便DNA甲基化检测的阳性检出率和特异性明显超出血液标本的甲基化检测。 单基因粪便DNA甲基化检测诊断CRC的检出率和特异性较低，多基因联合进行甲基化检测能提高CRC的检出率。但随着联合检测基因数的增多，检测的成本明显加大，高成本的检测方法不适用于大范围的CRC的筛查，因此在寻找具有高阳性检出率和特异性的同时，探索可降低检测成本的少部分的最适基因组合，是亟待解决的问题，这将对CRC筛查具有重大意义。因此，本研究拟将与CRC具有甲基化诊断标志物高潜能的Vimentin和SFRP2基因和新近发现的具有高潜能的CNRIP1和SNCA甲基化基因联合检测，通过不同的组合以确定阳性检出率和特异性，以期达到对CRC筛查的最佳组合。 目的： 1.明确CRC、腺瘤、增生性息肉和正常病例对照组粪便DNA提取物中CNRIP1、SNCA、SFRP2、Vimentin四个基因单独的启动子区甲基化状态；并分析其与临床病理资料的相关性。 2.探讨不同基因组合进行检测时甲基化阳性检出率之间的差异，选出具有高阳性检出率、特异性及较低检测成本的基因组合，明确多基因联合的甲基化状态用于CRC早期筛查的意义。 3.验证最优基因组合筛选CRC的临床敏感性及特异性，明确其与FOBT检测及粪便商品化试剂盒检测等筛查方法的优缺点。 方法： 1.单基因甲基化检测实验所需的粪便样本取自60例CRC病人、30例腺瘤病人、20例增生性息肉病人、25例阴性对照人群，采用MS-PCR技术分析CNRIP1、SNCA、SFRP2、Vimentin四个基因的单基因检测甲基化情况，通过SPSS22.0软件对数据进行χ2检验，分析这四个基因与CRC临床病理参数之间的关联，并比较四个基因单独甲基化检测与FOBT结果之间的差异。 2.应用SPSS22.0软件进行统计学分析，对比两个基因联合、三个基因联合、四个基因联合等不同组合的甲基化检测的检出率及特异性差异，筛选出兼顾阳性检出率和特异性的最佳基因组合。 3.用CRC诊疗指南中的高危人群条件作为标准，从住院病人中筛选出200名患者，作为临床验证的对象，采用粪便DNA甲基化检测方法对筛选出的最佳基因组合进行临床验证。同时将200名患者的粪便标本应用大肠癌商品化试剂盒进行检测，对比两者的临床敏感性及特异性。 结果： 1. CRC粪便DNA中CNRIP1、SNCA、SFRP2、Vimentin基因启动子甲基化阳性检出率分别为73.3％、60%、76.7%、81.7%，腺瘤患者分别为56.7%、46.7%、63.3%、60%，增生性息肉患者分别为20.0%、15.0%、10.0%、20.0%，正常对照人群分别为8.0%、4.0%、4.0%、12.0%，特异性分别为92.0%、96.0%、96.0%、88%，CRC患者和腺瘤患者之间无显著的差异，但与增生性息肉组、正常对照组存在显著性差异（P<0.05）。 2. CRC患者粪便DNA中CNRIP1、SNCA、SFRP2、Vimentin基因的甲基化程度与性别、年龄、癌变部位、病变分期、淋巴结转移、远处转移等临床病理参数无显著相关性。 3.两个基因联合检测时，CNRIP1和SNCA联合检测CRC的阳性检出率为85.0%， SFRP2和Vimentin联合检测CRC的阳性检出率为91.7%，CNRIP1和SFRP2联合检测CRC的阳性检出率为91.7%，CNRIP1和Vimentin联合检测CRC的阳性检出率为93.3%，SNCA和SFRP2联合检测CRC的阳性检出率为83.3%，SNCA和Vimentin联合检测CRC的阳性检出率为91.7%，特异性分别为88.0%、84.0%、92.0%、84.0%、92.0%、88.0%，均明显高于单个基因的检测。两个基因联合的组间阳性检出率及特异性未见明显差异（P>0.05）。 4.三个基因联合检测时，CNRIP1、SNCA、SFRP2联合检测CRC的阳性检出率为93.3%，CNRIP1、SNCA、Vimentin联合检测CRC的阳性检出率为96.7%，SNCA、SFRP2、Vimentin联合检测CRC的阳性检出率为96.7%，CNRIP1、SFRP2、Vimentin联合检测CRC的阳性检出率为98.3%，特异性分别为88.0%、80.0%、84.0%、80.0%。三个基因甲基化联合检测与两个基因甲基化联合检测进行组间率的比较，结果为部分组合表现出明显的差异(P<0.05)。三个基因联合的组间阳性检出率及特异性未见明显差异（P>0.05）。 5.四个基因联合检测时，CRC的阳性检出率为100%，特异性为80.0%。将四个基因甲基化联合检测与三个基因甲基化联合检测进行组间率的比较，结果未见明显差异（ P>0.05）。兼顾高阳性检出率和特异性，且检测成本较低的最佳基因组合为SNCA/SFRP2/Vimentin(阳性检出率为96.7%，特异性为84.0%)基因组合。 6.对SNCA/SFRP2/Vimentin组合进行200例CRC高危患者的临床验证，所有入组患者均行肠镜检查，以病理结果为金标准，SNCA/SFRP2/Vimentin基因组合对CRC的临床敏感性为88.2%，特异性为84.1%；CRC商品化试剂盒筛查CRC的临床敏感性为94.1%，特异性为90.2%，两种检测方法进行组间率的比较，结果无明显差异。 结论： 1. MS-PCR法提示粪便中CNRIP1/SNCA/SFRP2/Vimentin在CRC患者中表现出较高的甲基化水平。 2. CRC患者粪便DNA中CNRIP1、SNCA、SFRP2、Vimentin基因的甲基化程度与临床病理参数无明显相关性。 3.两个基因联合的阳性检出率明显高于单个基因的检测，三个基因联合优于两个基因，而四个基因进行联合检测的阳性检出率较三个基因的甲基化检测差异无统计学意义，其中SNCA/SFRP2/Vimentin基因组合是兼顾阳性检出率和特异性的最佳组合。 4.临床标本验证提示SNCA/SFRP2/Vimentin基因的临床敏感性及特异性为88.2%、84.1%；与CRC商品化试剂盒的检测结果比较无明显差异，且费用较CRC商品化试剂盒相对低廉，操作流程也相对简单。 5.多基因粪便DNA甲基化联合检测可明显提高筛查早期CRC的临床敏感性及特异性，较FOBT、电子结直肠镜、血液甲基化检测试剂盒等检测方法，具有非侵入性、无创伤、操作简便、成本较低、阳性检出率和特异性较高等优点，有望用于临床的大规模CRC的筛查。