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背景和目的:放射治疗是三大经典的肿瘤治疗手段之一。放疗在杀伤肿瘤细胞的同时也对患者体内增殖活跃的细胞造成损伤,尤其是对射线极为敏感的造血系统受到严重损伤,使肿瘤患者的造血和免疫系统功能障碍,引发多种并发症,严重影响患者的生活质量,增加了肿瘤治疗的难度。放射损伤后,造血功能障碍的主要原因之一就是射线杀伤了维持造血功能的造血干细胞。造血干细胞的增殖和分化受到细胞因子(造血生长因子)的调控,因此缓解辐射后造血功能抑制的常规方法是给予辐射病人细胞因子治疗,尤其是在放射治疗后立即给予细胞因子治疗以及细胞因子联合持续给药的治疗方法。研究发现,辐射后残存的造血干/祖细胞对细胞因子的增殖反应能力显著下降;持续给予数种细胞因子联合治疗引起炎症和免疫反应以及其他的副作用。能否通过改善造血干/祖细胞对细胞因子的反应性,促进造血系统功能的自然恢复,寻找天然物质替代细胞因子的治疗,减轻治疗的副作用,是血液系统疾病和肿瘤领域研究的热点问题。以往本实验室的研究表明,蝎毒多肽(scorpion venom polypeptide, SVP)不但可高选择性杀伤多种肿瘤细胞,增强带瘤小鼠的免疫力,还可减轻放化疗对骨髓造血功能抑制的副作用,具有保护辐射损伤小鼠造血干细胞及祖细胞,加速其增殖能力恢复的作用。M-NFS-60细胞为小鼠源性的造血因子依赖粒白血病细胞株,在一定程度上可反映正常造血干细胞的增殖特性。本研究采用该细胞作为实验对象,在前期研究的基础上,从蝎毒多肽的多种组分中筛选促进M-NFS-60细胞增殖作用最强的组分,并进一步研究这些组分对辐射后M-NFS-60细胞的促增殖作用及其可能的机制和信号转导途径。材料和方法:1.材料:1.1细胞株:M-NFS-60细胞,为依赖r-h-MCSF的小鼠粒白血病细胞株,购自美国ATCC公司(CRL-1838?)1.2 SVP:由广州医学院蛇毒研究所分离纯化赠予,包括粗毒(C)、SVP I1、SVP I2、SVP II1、SVP II2、SVP II3、SVP III1、SVP III2、SVP III3、SVP IV和SVP V(以下简称I1、I2、II1、II2、II3、III1、III2、III3、IV和V);经预实验后,从II3中分离出5个组分:A1、A2、A3、A4、A5,并经高效液相鉴定,其中A4、A5为纯品。2.方法:2.1 SVP有效组分的筛选:用AlamarBlueTM摄入法筛选SVP对M-NFS-60细胞有促增殖作用的组分,并确定其有效浓度,作为体外实验中SVP的使用浓度。取对数生长期M-NFS-60细胞用RPMI 1640培养液洗涤3次,台盼蓝染色计数活细胞,用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(含r-h-M-CSF62ng/ mL)调整细胞浓度为5×104cells/ mL,每孔80μL加入96孔板中;分别加入10μL生理盐水、不同浓度的SVP组分、IL-3(10ng/ mL)、SVP+IL-3;每组设3个平行孔;加入AlamarBlueTM10μL,常规培养48h,于全自动酶标仪上测各组吸光度值,再根据AlamarBlueTM方法既定公式换算出各实验组相对于对照组的细胞增殖率。. 2.2 SVP对辐射后M-NFS-60细胞促增殖作用的研究:M-NFS-60细胞经60Coγ-射线一次均匀照射,分组及实验方法同上。2.3 SVP对M-NFS-60细胞周期的影响: SVP处理辐射前或辐射后M-NFS-60细胞,用流式细胞术(FCM)检测其对细胞周期的影响,进一步观察SVP对M-NFS-60细胞的促增殖作用。2.4 SVP对IL-3R和M-CSFR表达的影响:分别用FCM、免疫荧光和Western blotting方法检测IL-3R和M-CSFR的表达水平。2.5 SVP对磷酸化蛋白STAT5表达的影响: SVP处理M-NFS-60细胞,分别用FCM和Western blotting方法检测磷酸化STAT5蛋白的表达水平。结果:1. SVP处理M-NFS-60细胞48小时后,在(0.5～5 )mg/L的终浓度范围内均可促进细胞的增殖,其中II3、IV 3mg/L浓度的作用最为显著,故选用3mg/L的SVPII3、IV为体外实验处理组分,3mg/L的SVP III3为对照。纯品A4、A5作用强于A1、A2、A3,这是本课题组首次得到的具有促进造血细胞增殖作用的蝎毒多肽纯品。2. M-NFS-60细胞经60Coγ-射线一次均匀照射后,加入II3、IV、III3(3 mg/L)和IL-3(10ng/ mL)以及II3+IL-3、IV+IL-3、III3+IL-3,作用48h,细胞的增殖率(﹪)分别为121.58±2.62 (II3)、123.39±4.45(III3)、123.51±5.04 (IV),140.12±1.68(IL-3),与空白对照组(100.00±0.01)相比具有显著性差异(P<0.01);II3、III3、IV分别与IL-3联用处理细胞48h后的增殖率分别为163.98±9.20(II3+IL3)、159.89±8.31(IV +IL3)、148.92±9.74(III3+IL3),与SVP处理组比较差异具有显著性(P<0.05)。3. SVP可增加M-NFS-60细胞S期的百分率,使辐射后细胞阻滞在G2-M期。4. SVP可上调M-NFS-60细胞IL-3R的表达水平。在足量M-CSF维持下,对细胞MCSFR无明显影响;在1/4浓度M-CSF维持下,可上调MCSFR的表达水平。5. SVP处理M-NFS-60细胞后,磷酸化蛋白STAT5的表达水平与对照组相比明显增高。综上所述,SVP可保护辐射损伤M-NFS-60细胞,加速其增殖能力恢复,并且可以上调M-NFS-60细胞IL-3R和磷酸化STAT5蛋白的表达水平;提示SVP促进辐射损伤后造血功能恢复的作用机理可能与细胞因子受体信号转导途径的激活有关。结论:1.本论文结果表明,SVPII3、IV、A4、A5等组分具有类细胞因子的作用,可以促进M-NFS-60细胞的增殖,并且与IL-3具有协同促增殖作用。2. SVP组分促M-NFS-60细胞的增殖作用与其上调IL-3R和M-CSFR的表达有关,并可能通过JAK-STATs通路发挥作用。3.首次分离得到了纯化的SVPA4、A5,并证实它们具有类细胞因子的作用,为进一步研究蝎毒多肽促进造血重建的作用和机制奠定了很好的基础,SVP单体也具有较好的应用前景。