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目的(1)基于回肠上皮细胞顶侧膜的Na+依赖性胆酸盐转运蛋白(apical sodium-dependent bile acid transporter,Asbt)相关的胆酸盐吸收障碍,考察伊立替康(Irinotecan,CPT-11)所致小鼠迟发型腹泻的机制；(2)基于维生素D受体(Vitamin D Receptor,VDR)/维甲酸X受体-α(retinoic X receptor-α,RXR-α)和维甲酸受体-β(retinoic acid receptor-β,RAR-β)/Rxr-α信号通路探究CPT-11对Asbt表达和/或功能的调控机制。方法(1)小鼠分为对照组和CPT-11组,分别尾静脉注射给予溶媒和CPT-11(40mg/kg/d)1天、2天、3天、4天,于末次给药后采集肝脏、回肠、结肠、血、胆汁、粪便。采用全自动生化仪测定总胆汁酸(total bile acid,TBA),液相质谱联用法(LC-MS/MS)定量测定不同组织或部位胆酸盐各成分的含量,并通过将回肠/结肠中代表性胆酸盐的浓度与其在胆汁中的浓度作比值来评价肠道胆酸盐重吸收能力。(2)分别采用Western Blot技术和RT-q PCR技术考察小鼠或Caco-2细胞中胆酸盐合成酶细胞色素P450酶系中的胆固醇7α-羟化酶(cholesterol 7-alpha hydroxylase,Cyp7a1)、甾醇27-羟化酶(sterol 27-hydroxylase,Cyp27a1)、回肠胆酸盐重吸收转运体Asbt/ASBT和有机溶质转运体(organic solute transportersα/β,Ostα/β)的蛋白及m RNA的表达。采用小鼠回肠原位循环实验评价回肠对胆酸盐的吸收能力,并通过单位Asbt蛋白表达量介导的胆酸盐回肠吸收量评价CPT-11对小鼠Asbt转运能力的影响。采用Caco-2细胞牛黄胆酸(tauro-cholic acid,T-CA)摄取实验评价CPT-11或其代谢物SN-38干预后对肠道上皮细胞ASBT功能的影响。(3)小鼠分为对照组、CPT-11组和CPT-11+Seq组,CPT-11+Seq组于实验第3天开始灌胃给予胆酸盐螯合剂考来烯胺(0.8 g/kg/d)连续4天。每日监测小鼠体重,观察每日腹泻程度并采用腹泻评分标准对腹泻程度进行评分,于末次灌胃后采集结肠组织进行组织病理学评价。(4)采用Western Blot和RT-q PCR技术分别考察CPT-11或SN-38对小鼠或Caco-2细胞中核受体Vdr/VDR、Rar-β/RAR-β、Rxr-α/RXR-α的蛋白及m RNA表达的影响,并通过同时给予Vdr激动剂1,25-二羟基维生素D3或Rar激动剂9-顺维甲酸考察核受体对Asbt的调控作用对小鼠体重和腹泻程度的影响。结果(1)小鼠给予CPT-11后,其胆酸池在给药2天、3天、4天后较对照组显著下降(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。回肠组织中TBA浓度在给药2天、3天、4天后较对照组显著下降(P<0.05,P<0.01,P<0.01),结肠组织中TBA浓度在给药3天和4天后较对照组显著增加(P<0.05,P<0.05),粪便TBA浓度在给药3天和4天后较对照组显著增加(P<0.05,P<0.05),且肝脏和胆囊中TBA的浓度在给药4天后较对照组也呈增加趋势。回肠T-CA、牛黄β鼠胆酸(tauro-β-muricholic acid,T-β-MCA)、鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)和胆酸(cholic acid,CA)的浓度在CPT-11干预后较对照组均显著降低。结肠去氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)在给药2天、3天、4天较对照组均显著性增加。粪便中DCA和T-CA在给药3天和4天较对照组均有所增加。(2)小鼠给予CPT-11后,肝脏中Cyp7a1的蛋白表达较对照组没有显著性差异,但Cyp27a1的表达显著增加(P<0.01)。和对照组相比,回肠组织中Asbt的蛋白表达在给药4天后明显下降(P<0.05),m RNA水平在给药3天和4天时显著下降(P<0.05,P<0.05)。Caco-2细胞ASBT蛋白考察结果显示,CPT-11可使未成熟ASBT表达增加,成熟ASBT表达减少。回肠原位循环实验结果显示,CPT-11组肝门静脉中牛黄鹅去氧胆酸(tauro-chenodeoxycholic acid,T-CDCA)的浓度较对照组显著下降(P<0.05),Asbt的转运率较对照组在给药2天(P<0.05)和4天(P<0.05)均有显著性下降。Caco-2细胞T-CA摄取实验显示,CTP-11或SN-38干预可使Caco-2对T-CA的摄取能力下降。(3)小鼠静脉给予CPT-11可引起体重明显下降,合用考来烯胺并未逆转体重下降。但合用考来烯胺后,其腹泻程度较单用CPT-11组有所缓解,死亡率下降,且结肠组织病理学变化有所改善。(4)CPT-11干预Caco-2细胞,和正常细胞相比,VDR、RAR-β、RXR-α的表达在干预12 h和24 h时均出现不同程度的下降。SN-38干预Caco-2细胞后,VDR的表达没有出现显著性差异;RAR-β的表达在干预12 h和24 h后5.0μM组(P<0.05,P<0.01)、10.0μM组(P<0.05,P<0.05)、20.0μM组(P<0.05,P<0.01)分别出现了不同程度的下降;RXR-α的表达在干预24 h后2.5μM组(P<0.05)、5.0μM组(P<0.01)、10.0μM组(P<0.01)、20.0μM组(P<0.01)分别出现了显著性下降。和对照组相比,小鼠回肠末端Vdr的表达在给药2天(P<0.05)、3天(P<0.01)、4天(P<0.01)时显著降低。Rar-β的表达在给药2天(P<0.05)和3天(P<0.01)时显著性增加。Rxr-α的表达在给药4天时下降(P<0.01)。m RNA的表达结果与蛋白表达结果基本一致。小鼠同时灌胃给予Vdr受体激动剂或Rar受体激动剂后体重均上升,腹泻程度有不同程度的缓解,腹泻致死率有不同程度的下降。结论(1)CPT-11对Asbt表达和功能的抑制是其导致胆酸盐吸收障碍的关键,也是其造成腹泻的主要机制之一。(2)CPT-11和/或SN-38主要通过VDR/RXR-α(Vdr/Rxr-α)或RAR-β/RXR-α(Rar-β/Rxr-α)通路调控靶基因ASBT(Asbt)的表达和功能,使ASBT(Asbt)的表达和功能下降,造成胆酸盐吸收障碍,进而引发腹泻。