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多元分析和超灵敏分析已成为生物医学领域中的发展方向,这促进了满足相应要求的荧光探针的发展。复合型荧光微球探针以固体微粒为载体,荧光物质为负载物,能够对荧光发射信号进行有效地调节。因此,它在多元分析和超灵敏分析中吸引了极大的关注和兴趣。在本论文的研究工作中,我们以聚苯乙烯微球和纳米二氧化硅微球为载体,利用荧光共振能量转移和上转换荧光等光学手段,制备了一系列具有特殊荧光发射性能的荧光微球并研究了它们的光学性质。主要内容包括以下几个方面：
(1)单色单分散聚苯乙烯荧光微球。我们引入了一种改进的两相分散聚合工艺,相比于传统的分散聚合法,两相分散聚合法避免了染料单体对粒子成核阶段的干扰,能够制备得到单分散的聚苯乙烯荧光微球。在此基础上,结合吸附、包裹和共聚的方法制备了一系列标记有不同荧光染料的单分散聚苯乙烯荧光微球。由于微球中负载了大量染料分子,它们都能发射很强的单色荧光。三种方法中包裹和共聚法能较有效地负载染料,获得了高染料含量的荧光微球,其中共聚法通过共价键结合的方式将染料固定在微球内部,能避免使用过程中染料分子的脱落和泄漏。在微球结构的保护作用下,负载在微球上的染料分子能有效的抑制荧光猝灭,而且使得荧光免受环境介质的影响,从而获得强而稳定的荧光发射信号。
(2)双色单分散聚苯乙烯荧光微球。采用两相分散共聚合法制备了单分散的同时负载有两种染料单体的聚苯乙烯荧光微球。选用的两种染料分别为N-乙烯基咔唑和丹磺酰烯丙基胺,它们的吸收光谱具有相当程度的重叠,但是Stokes位移相差很大,因此荧光发射光谱相互分离具有各自不同的发射带。制备的荧光微球在单一激发波长下呈现两个明业区分的荧光发射峰。通过控制微球中染料单体的含量可以调节两个荧光发射带的荧光强度及其比值,从而获得了编码的双色荧光信号。染料分子通过共价键键合在微球聚合物链中,有效地避免染料泄漏问题。聚苯乙烯微球壳给染料分子提供了很好的保护作用,一方面可阻隔环境介质对染料分子的影响；另一方面可以有效的固定染料分子,减少染料分子的非辐射失活。
(3)具有多重荧光信号的单分散聚苯乙烯微球。通过两相分散共聚合法制备了一系列单分散的负载有能量转移染料的荧光微球。两种染料为可聚合的1,8-萘酰亚胺荧光衍生物,染料给体的吸收光谱和染料受体的荧光光谱存在非常好的重叠,相互之间可以发生有效能量转移。制备微球的发射光谱和激发光谱研究也表明两种染料在微球中确实发生了能量转移。荧光微球在单一激发波长(染料给体的激发波长)下有两个可区分的荧光发射峰,分别对应两种染料的荧光。制备的系列微球中,两荧光峰处的荧光强度比值在0.23:1～1.71:1之间,绝对荧光强度也有数倍的变化,其荧光信号与微球中染料浓度呈一一对应的关系,已具有明显的编码信号特点。除此之外,它们的荧光发射信号强而稳定,微球中无染料分子泄漏的情况。这类粒径均匀的可荧光编码的微球在多元生物分析中有潜在的应用价值。
(4)具有大Stokes位移的聚苯乙烯荧光微球。通过溶剂蒸发法制备了负载有两种久洛呢啶染料的聚苯乙烯微球,微球中的染料浓度大大高于一般文献报道的浓度。在短波长400 mm激发下,微球荧光发射波长峰值在580 nm,Stokes位移达到180 nm。微球的荧光发射和激发光谱证明了微球中存在有效的荧光共振能量转移,这产生了大Stokes位移。研究发现给体和受体间较短的距离以及合适的给体和受体浓度能实现有效的荧光共振能量转移。在制备的系列微球样品中,当给体和受体的距离为1.94 nm、给体和受体的摩尔浓度比值为3.08:1时给体的荧光完全消失,获得了100％的能量转移效率。具有大Stokes位移的荧光微球能够有效地避免背景荧光、激发光和散射光的干扰,能够提高检测的灵敏度。
(5)具有反Stokes位移的单分散纳米二氧化硅微球。通过反相微乳液法制备了粒径均匀包埋有双光子吸收染料的纳米二氧化硅微球。染料掺杂的纳米二氧化硅微球分散液在近红外的800 nm激发下能发射峰值在620 nm左右的双光子激发荧光,具有反Stokes位移的特点,且其光谱与460 nm激发下的单光子荧光光谱的非常相似。这种长波激发波长不会被生物组织吸收能够穿透到组织的深层,发射波长是一种上转换荧光,其相对于激发波长有巨大的蓝移,可消除强烈散射光和背景光的影响。另外,双光子荧光激发还能消除不必要的光漂白和光毒化。与具有相当染料总浓度的溶液相比,染料掺杂的纳米二氧化硅微球其单光子和双光子荧光发射都明显蓝移且荧光发射能力大大增强。通过双光子荧光共聚焦显微镜观察了染料掺杂的纳米二氧化硅微球的细胞摄取标记实验,结果显示二氧化硅微球能够有效地被Hela细胞摄取,并能标记细胞的细胞膜和细胞质。
(6)合成了一系列微球负载用的荧光染料并研究它们的荧光性质。合成的染料包括久洛呢啶类、1,8-萘酰亚胺类、丹磺酰氯衍生物和吡啶盐类荧光化合物。这类具有推拉型结构化合物的吸收和荧光光谱染料都有明显、规则的溶剂效应。其中久洛呢啶类和吡啶盐类染料的在800 nm激发下还表现出强的双光子吸收和荧光,是很好的上转换荧光染料。