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大肠杆菌不耐热肠毒素(heat labile enterotoxin,LT)是产肠毒素大肠杆菌分泌的一种毒素蛋白,被认为是最具潜力的黏膜佐剂.但LT的毒性限制了其应用,采用点突变方法可制备减毒甚至无毒的LT突变体,从而获得无毒LT蛋白.鉴于LT重组蛋白在目前普遍使用的pET载体原核表达系统中是以包涵体形式存在,蛋白后续变复性过程比较繁琐,而且蛋白损失量大.本研究对LT重组蛋白的分泌表达进行了初步研究.同时对包涵体形式表达的重组蛋白变复性条件进行优化,以期提高重组蛋白产量和活性.实验以实验室保存的重组pET30-LTRG质粒为模版扩增LT全基因,连接到pcoldⅡ冷休克表达载体从而构建出重组pcoldⅡ-LTRG表达质粒并转化BL21(DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE电泳及Western Blot证实重组蛋白获得了表达,表达量占总菌体蛋白的10%,通过镍柱亲和层析获得了较纯的蛋白.为提高包涵体表达重组蛋白的得率,实验采用不同变复性溶液、不同PH值、及超滤/稀释等不同的复性方法,对包涵体表达的蛋白进行变复性.结果在pH8.0、pH8.5、pH9.0三种pH条件下复性的得率分别18.2%、28.8%、40.2%,采用甘氨酸-盐酸的低pH值缓冲系统对包涵体形式的LTA亚基和B亚基进行了稀释复性,得率为33%.纯化LTRG与新城疫疫苗(NDV)经滴鼻途径共免疫小鼠,通过ELISA检测小鼠血清IgG和局部黏膜IgA,并对血清中血凝抑制抗体进行检测.结果,可溶性表达的LTRG和pH9.0条件下复性的蛋白未表现出佐剂活性,小鼠血清IgG和黏膜IgA水平与不加佐剂组无明显差异；pH8.0、pH8.5两种条件下超滤复性的蛋白对小鼠IgG的增强作用比对照组明显强；对培A的增强作用则pH8.5组强.通过稀释复性获得的LTRG免疫小鼠后刺激小鼠产生的IgG和IgA抗体反应均明显好于无佐剂组和超滤复性LTRG组(p<0.05).添加LTRG蛋白各组小鼠血凝抑制抗体均高于未加LTRG蛋白组,且pH8、pH8.5条件下超滤复性LTRG的佐剂活性好于其它组,也高于稀释复性组,但pH8、pH8.5两组间差异不显著.以大剂量重组LTRG给小鼠滴鼻,组织学检查显示以可溶性形式表达和包涵体形式表达并复性的LTRG在小鼠鼻部黏膜、气管、肺、肝、肾均未造成明显病变,但野生型LT在小鼠肺部诱导出了明显的炎症反应,出现了肺泡壁增厚、大量炎性细胞浸润和出血等病变.本实验获得了一种对包涵体LT进行稀释复性的较好方法,复性得率高、复性效果好.组织学检查表明LTRG的经鼻免疫时的毒性明显小于野生型LT,为LTRG的开发应用提供了依据。