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急性肝衰竭（ALF）是一种罕见而严重的疾病,威胁着人类的健康。肝移植是治疗ALF最有效的方法。然而,由于供体器官缺乏、价格高昂等因素导致肝移植应用受限。因此,寻找治疗ALF的新方法迫在眉睫。肝细胞坏死导致肝脏募集大量的炎症细胞,进而引发全身炎症反应综合征（SIRS）为ALF的病理机制之一。因此,抑制炎症反应是治疗ALF的关键。小分子多肽LR12能够抑制髓样细胞表达触发受体1（TREM-1）的激活,对多种炎症疾病具有治疗作用。然而,LR12在ALF中的作用尚不清楚。肝再生不足以代偿肝细胞坏死,导致肝功能缺失,进而引发多器官功能衰竭是ALF的病理机制之一。肝脏是一个具有强大再生能力和显著调节最终质量能力的器官。以往的研究表明,肝再生是ALF存活的关键因素。然而,LR12是否能够促进肝再生尚不清楚。本研究建立了TAA诱导的ALF小鼠模型,观察LR12对ALF小鼠肝脏损伤的作用及肝再生的作用;通过体外建立TAA诱导的肝细胞损伤模型,探讨LR12促进肝细胞再生的机制;本研究通过细胞因子芯片技术筛选出LR12作用于巨噬细胞促进肝再生的关键因子,并通过体外和体内实验进一步验证。本课题主要包括以下四部分:第一部分LR12减轻TAA诱导的ALF小鼠肝脏损伤,促进肝细胞再生目的:本研究旨在建立硫代乙酰胺（TAA）诱导的ALF小鼠模型,观察LR12对ALF的治疗作用。方法:1.腹腔注射TAA建立ALF小鼠模型。实验分组:对照组、TAA组、LR12组及TAA+LR12组。2.苏木素-伊红（H&E）染色检测肝脏病理变化。赖氏法检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的含量。3.观察TAA组和TAA+LR12组小鼠的存活率。4.Western blot方法检测小鼠肝脏中PCNA的表达。5.激光共聚焦（CLSM）方法检测小鼠肝脏中肝细胞标志角蛋白18（CK18）与增殖指标增殖细胞核抗原（PCNA）的共定位及表达情况。结果:1.造模后,TAA组小鼠肝脏可见肝细胞出血性坏死,而TAA+LR12组肝细胞出血性坏死面积减少（P<0.001）。2.TAA组ALT、AST水平较对照组显著升高,而TAA+LR12组ALT、AST水平较TAA组显著降低（P<0.01）。3.TAA+LR12组小鼠存活率显著高于TAA组（P<0.05）。4.TAA+LR12组小鼠肝脏中PCNA蛋白表达量较TAA组上调（P<0.01）。5.与TAA组相比,TAA+LR12组小鼠肝脏中CK18与PCNA共定位的细胞数显著增多（P<0.001）。结论:LR12能够减轻TAA诱导的ALF小鼠肝脏损伤,促进肝细胞再生。第二部分:LR12通过作用于巨噬细胞促进TAA诱导的肝细胞损伤模型中肝细胞增殖目的:本研究旨在建立TAA诱导的肝细胞损伤模型,研究LR12促进肝细胞再生的机制。方法:1.建立不同浓度TAA诱导的LO2细胞损伤模型,Western blot方法检测PCNA的表达。2.应用TAA或联合LR12刺激LO2细胞,CLSM和Western blot方法检测PCNA的表达。3.应用TAA或联合LR12刺激巨噬细胞后的上清液刺激LO2细胞或原代肝细胞,CLSM和Western blot方法检测PCNA的表达。4.流式细胞术（FCM）检测LO2细胞的细胞周期。结果:1.1 mM TAA组、2 mM TAA组LO2细胞中PCNA蛋白表达量较对照组显著降低（P<0.05）。2.TAA组LO2细胞中PCNA蛋白表达量较对照组显著降低,而TAA+LR12组PCNA蛋白表达量较TAA组无显著变化（P>0.05）。3.Supernatant-TAA组LO2细胞中PCNA蛋白表达量较对照组显著降低,而Supernatant-TAA+LR12组PCNA蛋白表达量较Supernatant-TAA组显著升高（P<0.01）。原代肝细胞的结果与LO2细胞的结果一致。4.Supernatant-TAA组LO2细胞S期细胞比例较对照组显著降低,而Supernatant-TAA+LR12组S期细胞比例较Supernatant-TAA组显著增多（P<0.01）。结论:LR12通过作用于巨噬细胞促进TAA诱导的肝细胞损伤模型中肝细胞增殖。第三部分:LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生目的:本研究旨在探讨LR12作用于巨噬细胞促进肝细胞再生的机制。方法:1.应用细胞因子芯片技术筛选TAA或联合LR12刺激巨噬细胞上清液中与增殖相关的细胞因子。2.酶联免疫吸附实验（ELISA）方法及实时荧光定量聚合酶链反应（q-RT-PCR）方法检测C-C趋化因子配体20（CCL20）的表达。3.建立TAA诱导的ALF小鼠模型,CLSM方法检测巨噬细胞标志F4/80与CCL20的共定位及表达情况。4.将LO2细胞分为对照组,TAA组,CCL20组及TAA+CCL20组,Western blot方法检测PCNA的表达。5.将LO2细胞分为Supernatant-TAA+LR12组和Supernatant-TAA+LR12+anti-CCL20组,Western blot方法检测PCNA的表达。6.将小鼠分为TAA+LR12+Ig G组和TAA+LR12+anti-CCL20组,H&E染色检测肝脏病理变化。7.赖氏法检测血清ALT、AST的含量。8.CLSM方法检测小鼠肝脏中肝细胞标志CK18与PCNA的共定位及表达情况。结果:1.Supernatant-TAA组巨噬细胞上清液中CCL20蛋白表达量较对照组显著降低,而Supernatant-TAA+LR12组CCL20蛋白表达量较Supernatant-TAA组显著升高（P<0.05）。2.ELSA及PCR结果与芯片结果一致。3.与TAA组相比,TAA+LR12组小鼠肝脏中F4/80与CCL20共定位细胞数显著升高（P<0.001）。4.TAA组LO2细胞中PCNA蛋白表达量较对照组显著降低,而TAA+CCL20组PCNA蛋白表达量较TAA组显著升高（P<0.01）。5.与Supernatant-TAA+LR12组相比,Supernatant-TAA+LR12+anti-CCL20组LO2细胞中PCNA蛋白表达量显著降低（P<0.01）。6.与TAA+LR12+Ig G组相比,TAA+LR12+anti-CCL20组小鼠肝细胞出血性坏死面积显著增加（P<0.001）。7.与TAA+LR12+Ig G组相比,TAA+LR12+anti-CCL20组小鼠ALT、AST水平显著升高（P<0.05）。8.与TAA+LR12+Ig G组相比,TAA+LR12+anti-CCL20组小鼠肝脏中CK18与PCNA共定位的细胞数显著减少（P<0.001）。结论:LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生。第四部分:LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20激活肝细胞内p38 MAPK途径促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生目的:本研究旨在阐明LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20调控肝细胞再生的机制。方法:1.应用TAA或联合LR12刺激巨噬细胞后的上清液刺激LO2细胞,Western blot方法检测LO2细胞中p-p38的表达。2.建立TAA诱导的ALF小鼠模型,提取原代肝细胞,Western blot方法检测原代肝细胞中p-p38的表达。3.将LO2细胞分为Supernatant-TAA+LR12组和Supernatant-TAA+LR12+anti-CCL20组,Western blot方法检测LO2细胞中p-p38的表达。4.将小鼠分为TAA+LR12+Ig G组和TAA+LR12+anti-CCL20组,CLSM方法检测肝细胞中p38的核转位情况。结果:1.Supernatant-TAA组LO2细胞中p-p38蛋白表达量较对照组显著降低,而Supernatant-TAA+LR12组p-p38蛋白表达量较Supernatant-TAA组显著升高（P<0.01）。2.TAA+LR12组小鼠原代肝细胞中的p-p38蛋白表达量较TAA组显著上调（P<0.05）。3.与Supernatant-TAA+LR12组相比,Supernatant-TAA+LR12+anti-CCL20组LO2细胞中p-p38蛋白表达量显著下调（P<0.001）。4.与TAA+LR12+anti-CCL20组相比,TAA+LR12+Ig G组小鼠可见肝细胞中p38核转位。结论:LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20激活肝细胞内p38 MAPK途径促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生。