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天然免疫模式识别受体 NLRs(Nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat-containing receptors)家族不仅参与入侵病原微生物的识别,而且广泛参与免疫应答的调节。NLRX1(NLR family member X1)是该家族中重要成员之一。本研究克隆鸡NLRX1(chNLRX1)全长cDNA序列,通过生物信息学分析、蛋白表达、细胞定位、siRNA干扰以及炎症诱导等方面的研究,初步探讨chNLRX1的分子结构特征及其生物学功能。1.chNLRY1基因克隆、原核表达与抗体制备通过比对分析NCBI数据库登录的多个物种NLRX1基因序列,以雏鸡肺脏组织总RNA反转录cDNA为模板,经RT-PCR和cDNA末端快速克隆(RACE)方法分别扩增chNLRY1的保守序列和5’/3’末端序列,经拼接获得长度为3225bp cDNA序列(GenBank登录号:MH704638.1),最长开放阅读框(ORF)为2970bp,经同源性分析显示chNLRX1与哺乳动物、野鸭和鱼类NLRX1基因的同源性为53.2%～86.5%;chNLRY1基因预测编码989个氨基酸,含有相对保守的NACHT和LRR结构域,分子构象分析显示chNLRX1空间结构上更接近于鱼类NLRX1。应用PCR方法分别扩增chNLRX1的编码区(chNLRX1-ORF)和N端1-492bp(chNLRX1-part)基因序列,连接原核表达载体pET-32a(+),转化至E.coli Rosseta感受态细胞,通过IPTG诱导表达获取chNLRX1全蛋白和截短表达(chNLRX1-part/His)融合蛋白;纯化chNLRX1-part/His蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,通过Western blot方法检测显示抗体可特异性识别chNLRX1融合蛋白。2.chNLRX1真核表达与亚细胞定位应用PCR扩增chNLRY1编码区基因插入真核表达载体pmCherry-C1和pEGFP-C1真核表达载体,构建chNLRX1真核表达重组质粒,以脂质体介导转染HEK293T细胞和鸡DF-1细胞,利用荧光染料Hoechst 33342和Mito Tracker Red对细胞核进行染色和标记线粒体,通过显微荧光观察和Western blot检测显示chNLRX1主要定位于细胞质内的线粒体区。这表明chNLRX1具有类似于其他动物NLRX1的线粒体定位功能。3.chNLRX1组织分布和细胞内诱导表达提取15日龄青脚麻雏鸡胸腺、脾脏、肺脏、肝脏、肾脏以及骨髓等6种组织总RNA并反转录制备cDNA,建立SYBR Green I荧光相对定量RT-PCR(RT-qPCR)方法分析组织中chNLRX1分布情况。结果显示,胸腺中chNLRX1表达水平相对较高,肝脏中相对表达较低。以10μg/mL LPS处理鸡DF-1细胞,通过RT-qPCR检测0～24h胞内chNLRX1以及炎症细胞因子IL-6和TNF-α的mRNA水平。结果显示,LPS处理在2h时可诱导chNLRX1 mRNA明显上调,此后显著下调;IL-6mRNA表达在2h之后显著下调;TNF-α转录水平直至24h(与8h相比)上调显著。以细胞比细菌为1:50和1:100剂量的鸡白痢沙门氏菌孵育鸡巨噬细胞HD11,通过相对定量RT-qPCR方法检测感染1、3和5h时,chNLRX1、NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6的转录水平变化。结果显示,1:50低剂量沙门氏菌在3h时明显诱导chNLRX1转录;而1:100高剂量刺激直至5h时chNLRX1才有明显变化;炎症因子IL-1β在低剂量细菌刺激5h和高剂量刺激3-5h均显著上调,其他细胞因子相对变化较小。由此说明,低剂量沙门氏菌感染早期更能刺激chNLRX1明显表达,且与细菌感染剂量和细胞因子IL-1β水平有关。4.chNLRX1表达的siRNA干扰根据鸡NLRX1基因转录本设计3个siRNA干扰序列,命名为sh-NLRX1-1、sh-NLRX1-2 和 sh-NLRX1-3。将 chNLRX1-GFP 重组质粒转染 HEK293T 细胞,同时以腺病毒介导shRNA和对照序列(sh-Ctrl)孵育细胞,36h后通过显微荧光观察和Western blot检测方法分析干扰效果。结果显示,与sh-Ctrl干扰对照相比,3个干扰组尤其是sh-NLRX1-2可明显降低NLRX1过表达的荧光强度,继而经Western blot分析表明sh-NLRX1-2效果最好,其干扰效率达到87%。综上所述,本研究首次克隆并分析鸡天然免疫受体NLRX1基因及其分子特征,通过原核表达NLRX1蛋白制备了抗NLRX1抗体;应用细胞转染和显微荧光分析,明确了鸡NLRX1在真核细胞中具有线粒体定位功能;以RT-qPCR分析显示6种鸡组织以胸腺中NLRX1表达相对较高,LPS刺激和鸡白痢沙门氏菌感染均能明显影响细胞NLRX1表达;最后筛选并建立腺病毒介导siRNA干扰方法,为进一步研究鸡NLRX1生物学功能奠定基础。