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研究背景：外周T细胞淋巴瘤(peripheral T-cell lymphomas, PTCLs)是指成熟T细胞、胸腺后T细胞及自然杀伤(NK)细胞来源的恶性血液病,异质性高,病情发展快,是侵袭能力最高的非霍奇金淋巴瘤(NHL),约占NHL的15%,该疾病具有地域性特征,亚洲人群发病高于欧美国家,通常原发于咽喉或鼻腔部分,少数原发于皮肤,目前尚无标准化疗方案,传统的CHOP或CHOP样方案仍被广泛应用,化疗效果差,易复发,长期生存率仅为10%-30%,预后不良。T细胞受体(T-cell receptor, TCR)信号通路在T细胞发生过程及其功能发挥中有重要作用,并与外周T细胞淋巴瘤的发病密切相关。ITK(Interleukin-2 (IL-2)-inducible T cell kinase)是TCR通路的关键酶,在PTCLs组织中的表达明显高于淋巴结炎组织,与PTCLs的恶性程度及肿瘤转移有关,可用于疾病诊断及病情预后,是非常有潜力的抑制靶点。BTK、ITK、Syk是非受体蛋白质酪氨酸激酶TEC家族的重要成员,与免疫细胞的分化、发育、增殖及凋亡密切相关,其过度激活或过度表达是肿瘤的发生、发展的机制之一。依鲁替尼是布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase, BTK)不可逆的抑制剂,通过与BTK的活性位点半胱氨酸残基(Cys-481)选择性结合形成共价键抑制BTK的自我磷酸化激活。目前依鲁替尼主要应用于B细胞肿瘤的治疗,在针对CLL、MCL、MM的临床实验中具有非常好的疗效,临床应用前景可观。同时,依鲁替尼被证实对ITK也有不可逆的抑制作用。目前,国内外还未见依鲁替尼对PTCLs调控作用的报道。本研究中,我们通过研究依鲁替尼在PTCLs细胞株KARPAS-299 and HUT-78中的毒性作用及其作用机制,探讨外周T细胞淋巴瘤的治疗的新药物。研究目的：检测依鲁替尼对外周T细胞淋巴瘤细胞株(HUT-78及KARPAS-299)增殖及凋亡的调控,并探讨Wnt通路在其中的作用,为外周T细胞淋巴瘤的治疗提供新的方法及思路。研究方法：1. 设立药物浓度梯度(0,1,10,20,50,100μmol)作用于HUT-78及KARPAS-299、正常人T细胞,采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率,观察依鲁替尼对PTCLs细胞株及正常人T细胞增殖的影响。2. 相差显微镜观察不同药物浓度(0, 1Oμmol)处理后细胞形态学改变。3. 设立药物浓度梯度(0,1,10,20 μmol),相差显微镜观察细胞形态学变化,采用Annexin V-PI/FITC细胞凋亡双染试剂盒测定依鲁替尼处理后的细胞凋亡率,观察依鲁替尼对PTCLs细胞凋亡的影响。4. 采用RT-PCR检测依鲁替尼处理后细胞(药物浓度为0,1, lOμmol) β-catenin及LEF-1基因mRNA的表达水平的变化,观察依鲁替尼对β-catenin及LEF-1基因表达的影响。5. 采用Western blot检测依鲁替尼处理后细胞(药物浓度为0,1,10,20μmol) β-catenin及LEF-1蛋白水平表达的变化,观察依鲁替尼对β-catenin及LEF-1蛋白表达的影响。研究结果：1.依鲁替尼处理HUT-78及KARPAS-299,正常人T细胞细胞后,两种肿瘤细胞的增殖均被明显抑制(IC50分别为13.34 μmol及19.05μmol)(p<0.01)呈药物浓度依赖性及时间依赖性。正常人T细胞增殖未受明显抑制(p>0.05)。2.依鲁替尼处理HUT-78及KARPAS-299细胞后,两种细胞的细胞团减小,细胞数目减少,异形细胞增多。3.依鲁替尼处理HUT-78及KARPAS-299细胞后,两种细胞的凋亡率均明显升高(p<0.01),呈药物浓度依赖性。4.依鲁替尼处理HUT-78及KARPAS-299细胞后,两种细胞的(3-catenin及LEF-1基因在mRNA水平的表达被明显抑制(p<0.05),呈药物浓度依赖性及时间依赖性。5.依鲁替尼处理HUT-78及KARPAS-299细胞后,两种细胞的β-catenin及LEF-1在蛋白水平的表达被明显抑制(p<0.05),呈药物浓度依赖性。研究结论：依鲁替尼通过Wnt通路作用于外周T细胞淋巴瘤细胞株,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。依鲁替尼有望成为治疗外周T细胞淋巴瘤的新药物。