论文部分内容阅读
结肠癌是我国高发的恶性肿瘤，占胃肠道恶性肿瘤的第三位，其发病率逐年增高，且有年轻化趋势。结肠癌诊断主要依赖肠镜及腹部CT等手段，故大多数患者明确诊断时已处于癌症晚期失去了手术治疗的机会，因此寻找特异的早期诊断标记及分子治疗靶点十分重要。鱼精蛋白（protamines，PRM）被认为与男性不育有关，最新研究表明，PRM1可能是一个新的结肠癌相关的肿瘤/睾丸（Cancer/Testis,CT）抗原基因。本研究的目的在于通过检测结肠癌组织中PRM1-mRNA和蛋白水平的变化，阐述PRM1在临床诊断结肠癌中的意义及其作为基因治疗靶点的可能性。具体研究如下：1实验路线1.1收集结肠癌患者外周血，分离血清；收集结肠癌组织、正常结肠组织。1.2实时定量PCR比较结肠癌组织与正常结肠组织PRM1mRNA表达水平差异。1.3PRM1mRNA检测用于结肠癌诊断敏感性分析。1.4免疫组织化学染色观察PRM1在结肠癌组织中的表达。1.4.1结肠癌组织PRM1表达水平与正常结肠组织PRM1表达水平差异比较。1.4.2高、中、低分化结肠腺癌组织PRM1表达水平差异比较。1.5western blot检测比较结肠腺癌与正常结肠组织PRM1表达水平差异。1.6ELISA试验检测结肠癌患者血清PRM1水平。1.6.1结肠癌患者血清PRM1水平与健康人差异比较。1.6.2不同分期结肠癌患者血清PRM1水平差异比较。1.6.3高、中、低分化结肠腺癌患者血清PRM1水平差异比较。1.6.4PRM1血清检测用于结肠癌诊断的阳性率。1.7ELISA试验检测结肠癌患者血清CEA水平。1.8血清PRM1、CEA检测用于结肠癌诊断敏感性比较。2结果2.1结肠癌PRM1mRNA表达水平高于正常结肠组织53例结肠癌组织平均PRM1-mRNA含量显著高于正常结肠组织，P=0.01116。将定量PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过辉度扫描比较结肠癌与正常结肠组织PRM1mRNA表达差异，结果与定量PCR结果一致。2.2组织PRM1mRNA检测用于结肠癌诊断敏感性分析以结肠癌组织中PRM1-mRNA含量大于等于正常结肠组织PRM1-mRNA含量的2倍以上记为PRM1-mRNA表达阳性。统计结果显示，53例结肠癌病例PRM1mRNA检测总体阳性率为96.2%（51/53）。2.3免疫组织化学染色观察PRM1在结肠癌组织中的表达实验采取免疫组织化学染色的方法检测结肠癌组织表达PRM1表达及确定组织分布特点。结果显示，结肠癌细胞胞浆内及癌细胞围成的腺腔内可见PRM1阳性染色颗粒，正常结肠组织细胞内无明显PRM1阳性染色。低分化腺癌细胞内PRM1染色强度明显高于高分化腺癌细胞。2.4western blot检测PRM1在结肠癌组织中的表达实验采取western blot的方法检测结肠癌组织与正常结肠组织表达PRM1水平差异。结果显示，结肠癌组织PRM1水平远远高于正常结肠组织，与免疫组化实验一同证明，结肠癌组织整体PRM1表达水平高于健康结肠组织。2.5ELISA试验检测结肠癌患者血清PRM1水平2.5.1结肠癌患者血清PRM1水平与健康人差异比较ELISA试验检测结肠癌患者与健康成年人血清PRM1水平，结果显示，结肠癌患者血清PRM1水平显著高于健康成年人，P<0.05。2.5.2PRM1血清检测用于结肠癌诊断的阳性率根据健康成年人PRM1血清水平的95%可信区间判断结肠癌患者血清水平阳性率，结果显示，结肠癌患者血清PRM1检测阳性率为80%（24/30）。2.5.3不同分期结肠癌患者血清PRM1水平差异比较比较T1NXMX、T2NXMX、T3NXMX结肠癌患者血清PRM1水平，结果显示，各组患者血清PRM1水平无明显差异，提示结肠癌患者血清PRM1水平升高程度与肿瘤T分期无关。2.5.4高、中、低分化结肠腺癌患者血清PRM1水平差异比较按结肠腺癌细胞病理分化程度比较患者血清PRM1水平差异，结果显示，低分化结肠癌患者血清PRM1水平与中分化结肠癌患者相比，差异无显著性，P>0.05。2.6ELISA试验检测结肠癌患者血清CEA水平ELISA试验检测结肠癌患者与健康成年人血清CEA水平，结果显示，结肠癌患者血清CEA平均水平显著高于健康成年人平均水平，P<0.05。2.7血清PRM1、CEA检测用于结肠癌诊断敏感性比较临床上常用CEA作为结肠癌等肿瘤的血清学诊断标记，故将PRM1与CEA用于结肠癌诊断的敏感性进行比较，结果显示，血清PRM1用于结肠癌诊断的阳性率为80%（24/30），血清CEA用于结肠癌诊断的阳性率为30%（9/30）。经过统计学检验，p<0.05。证实PRM1用于结肠癌诊断的敏感性高于CEA。3结论3.1PRM1mRNA在结肠癌中含量显著高于正常结肠组织。3.2结肠腺癌细胞及癌细胞围成的腺腔内可见PRM1蛋白阳性染色，且PRM1表达水平与结肠腺癌细胞分化度有关。提示PRM1可能通过自分泌/旁分泌的方式作用于肿瘤细胞。3.3Western blot实验进一步证明，结肠腺癌组织比正常结肠组织PRM1表达水平显著高于正常肠组织。3.4结肠癌患者外周血中PRM1水平高于健康成年人，提示PRM1可能通过内分泌的方式作用于远处组织及细胞，具体作用及作用方式有待于进一步研究。3.5血清PRM1水平用于结肠癌诊断的阳性率高于CEA。