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研究背景：脑缺血后的炎症反应在其病理生理发生过程中起了重要作用。脑缺血损伤发生后,促进外周和中枢神经系统的促炎症因子表达并分泌至细胞外,诱导脑内炎症变化,其结果之一是激活星形胶质细胞并逐渐形成胶质疤痕,研究炎症因子激活星形胶质细胞,有助于了解胶质疤痕形成机制和干预途径。脑缺血后脑内炎症因子包括转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)以及半胱氨酰白三烯类(cysteinyl leukotrienes, CysLTs)。TGF-β1被广泛认为是一种与损伤相关的细胞因子,CysLTs是一类重要的炎症介质,两者在脑缺血、脑外伤等中枢神经系统损伤性疾病发病中均起重要作用。TGF-β1在正常脑组织中表达水平不高。脑缺血后,TGF-β1mRNA在脑组织中早期(缺血后6h)表达增加,缺血后2-4天达高峰,持续14-26天；缺血早期在全脑弥散表达,7-14天后主要表达于星形胶质细胞,与脑缺血后胶质疤痕的形成有关；体外实验表明,TGF-β1能够诱导星形胶质细胞增生肥大；促进星形胶质细胞迁移。CysLTs由5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)催化花生四烯酸而形成,其作用通过半胱氨酰白三烯受体(cysteinyl leukotriene receptor, CysLT受体)起作用,该类受体主要包括CysLT1和CysLT2受体两种亚型。CysLT1受体在正常脑组织中表达水平不高。脑缺血后,缺血中心区CysLT1受体mRNA在缺血再灌注3、6、12h和7、14天表达上调；缺血周边区,再灌注后3天内CysLT1受体mRNA水平没有变化,7、14天明显增高,主要表达于增生的星形胶质细胞。药理学研究表明,CysLT1受体抑制剂pranlukast抑制小鼠局灶性脑缺血后诱导的胶质疤痕形成。在大鼠星形胶质细胞,轻度缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation, OGD)诱导CysLT1受体表达,并介导体外星形胶质细胞的增殖、激活；而CysLT2受体则介导中度OGD诱导的星形胶质细胞损伤。CysLT1受体介导星形胶质细胞激活的机制尚待阐明。由于星形胶质细胞激活受多种因素调节,CysLT1受体的效应可能与其他因素存在相互作用。在外周组织中,TGF-β1能上调支气管平滑肌细胞中CysLT1受体的表达,增强LTD4的促增殖作用；TGF-β1能上调胎儿肺成纤维细胞中CysLT1受体的表达；TGF-β1能增加树突状细胞中5-LOX和5-LOX激活蛋白(FLAP)的表达,增加白三烯的合成。而在中枢神经系统中,TGF-β1与CysLTs及其受体之间是否有相互调节的作用?如何调节?尚待阐明。尤其对星形胶质细胞激活,TGF-β1与CysLT1受体的相互作用,是本文拟阐明的问题。研究目的：本文拟观察半胱氨酰白三烯及CysLT1受体与TGF-β1在调节星形胶质细胞中的相互作用,进行以下几个方面的研究：1.首先,阐明CysLT1受体是否与TGF-β1相互作用。观察TGF-β1以及CysLT受体相关药物对细胞活性的影响,包括5-LOX抑制剂、CysLT1和CysLT2受体激动剂和拮抗剂。2.其次,进一步阐明TGF-β1与CysLT1受体之间的可能相互作用。重点观察TGF-β1与CysLT受体激动剂、拮抗剂及siRNA对星形胶质细胞激活的作用,包括对增殖和迁移作用的影响。3.然后,为了阐明TGF-β1与CysLT1受体之间的相互作用特点,从两个方面进行解析,一方面分析TGF-β1对CysLT1受体及其内源性激动剂CysLTs合成酶5-LOX的调节作用；另一方面,分析CysLT,受体激动剂对TGF-β1的调节作用。4.最后,为了阐明TGF-β1与CysLT1受体之间的相互作用的意义,在以往轻度OGD(1h)增强CysLT1受体表达及效应结果的基础上,观察轻度OGD是否增加TGF-β1释放。研究方-法：选用原代培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞作为细胞模型,细胞划痕方法检测细胞迁移；MTT还原试验法检测细胞活性；流式细胞术检测细胞的增殖；细胞免疫化学法检测细胞中5-LOX的核膜移位；ELISA法检测CysLTs释放;RT-PCR、 Western blot和细胞免疫荧光法检测细胞中5-LOX、CysLT1受体和CysLT2受体表达。以CysLT受体非选择性激动剂LTD4、CysLT2受体激动剂NMLTC4、TGF-β1信号抑制剂repsox,5-LOX抑制剂齐留通(zileuton), CysLT,受体选择性拮抗剂孟鲁司特(montelukast)知CysLT2受体选择性拮抗剂Bay cysLT2进行药理学干预处理,CysLT,受体siRNA进行基因干扰处理。在大鼠大脑皮层星形胶质细胞中,以OGD1h和4h诱导缺血性损伤。以MTT法、LDH法检测OGD/恢复(OGD/R)后星形胶质细胞的活性及损伤程度,并以ELISA法检测TGF-β1释放。研究结果：1. TGF-β1与CysLT受体对星形胶质细胞活性的影响原代培养的大鼠星形胶质细胞中,MTT还原试验法表明,TGF-β1和CysLT受体非选择性激动剂LTD4可增强细胞活性,并且,两者有相互增强；而CysLT2受体激动剂NMLTC4则无作用。TGF-β1的作用可被5-LOX抑制剂zileuton、CysLT1受体拮抗剂montelukast减弱,而CysLT2受体拮抗剂Bay cysLT2则无作用。这一结果初步表明TGF-β1与CysLT1受体的相互作用。2.TGF-β1与CysLT1受体对星形胶质细胞增殖和迁移功能的影响为了进一步阐明TGF-β1与CysLT1受体的相互作用,观察了TGF-β1与CysLT受体相关药物对星形胶质细胞增殖及迁移的作用。流式细胞术检测结果显示,不同浓度的TGF-β1与LTD4在24h内对星形胶质细胞的增殖均没有显著影响。细胞划痕法检测显示,TGF-β1能够促进星形胶质细胞的迁移活性(划痕愈合),并呈一定的时间剂量依赖性；低浓度LTD4(0.1-10nM)也能促进星形胶质细胞的迁移,两者合用具有协同作用。NMLTC4(0.01～100nM)对星形胶质细胞迁移没有影响。TGF-β1信号抑常剂repsox能够完全逆转TGF-β1的作用；5-LOX抑制剂齐留通(zileuton), CysLT1受体选择性拮抗剂孟鲁司特(montelukast)及CysLT1受体siRNA处理后均能减弱TGF-β1的作用；但CysLT2受体选择性拮抗剂BaycysLT2对TGF-β1的作用没有显著影响。这一结果表明,CysLT1受体及其内源性配体合成酶5-LOX介导TGF-β1促进星形胶质细胞激活(迁移增强)的作用。3. TGF-β1与5-LOX/CysLT,受体的相互调节作用为了阐明TGF-β1与CysLT1受体相互作用的特点,观察了两者间的相互调节。RT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光法检测细胞显示,TGF-β1上调5-LOX和CysLT1受体表达,对CysLT2受体表达没有显著影响。细胞免疫化学法检测显示,TGF-β1作用于星形胶质细胞6h后发生5-LOX明显的移位,从细胞浆转移至细胞核膜上,24h后恢复。ELISA法检测显示,TGF-β1作用于星形胶质细胞1.5h后细胞培养基中的CysLTs含量显著增加,12h时达到高峰,维持到24h。另一方面,RT-PCR和ELISA法检测显示,不同浓度的LTD4或NMLTC4(1-100nM)作用于星形胶质细胞,对细胞中TGF-β1的表达和释放均没有显著影响。这一结果表明,TGF-β1与CysLT1受体相互作用的形式,是TGF-β1增加CysLT1受体内源性配体的产生,并增加CysLT1受体表达,从而增强CysLT1受体的效应；但是,CysLT1受体对TGF-β1没有明显影响。4.轻度OGD诱导TGF-β1释放以往报道,轻度OGD增强CysLT1受体表达并激活星形胶质细胞,在此验证了这一现象与TGF-β1之间的关系。结果显示,OGD1h恢复不同时间(48h和72h)后,细胞的活性依次增强,LDH释放没有显著变化；OGD1h后恢复12h,TGF-β1释放显著增高。但是,中度OGD(4h)损伤诱导星形胶质细胞损伤,而TGF-β1释放没有改变。这表明轻度缺血性损伤后星形胶质细胞激活与TGF-β1/CysLT1受体调节密切相关。结论：1.星形胶质细胞活性的药理学实验中,初步表明TGF-β1与CysLT1受体及5-LOX存在相互作用。2.对星形胶质细胞激活(增殖和迁移)的作用表明,CysLT1受体及其内源性配体合成酶5-LOX介导TGF-β1促进星形胶质细胞迁移增强的作用,但它们对细胞增殖无明显影响。3.相互作用特点的研究结果表明,TGF-β1与CysLT1受体相互作用的形式是TGF-β1增加CysLT1受体内源性配体的产生,并增加CysLT1受体表达,从而增强CysLT1受体的效应；但是,CysLT1受体对TGF-β1没有明显影响。4.轻度OGD(1h)可增加TGF-β1释放,表明轻度缺血性损伤后星形胶质细胞激活与TGF-β1/CysLT1受体调节密切相关。