益生菌是一种可以替代抗生素的安全的饲料添加剂,添加到饲料中能够预防疾病并促进机体生长。而芽孢杆菌因为能够产生芽孢,在极端环境以及长期储存过程中保证活菌数,成为益生菌的热选之一。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)能够产生一些抗菌物质和营养物质,比如氨基酸、维生素K、维生素B12,促进机体对营养物质吸收,提高生长性能。其次B.subtilis能够快速消耗肠道中的氧气,维持厌氧环境,促进厌氧有益菌的生长,抑制需氧有害菌生长。先天性免疫系统是机体抵御各种病原微生物入侵的第一道防线。模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)与病原微生物的识别和清除有关,NOD样受体(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)是其中重要的一个家族,是介导炎症反应和免疫应答的关键因子。NLRs能够识别B.subtilis,从而激活炎症反应促进细胞因子分泌。但是B.subtilis诱导机体免疫应答机制尚不清楚。为了寻找替代抗生素的优良益生菌,本研究从土壤中分离B.subtilis,并进行筛选。首先为了确认菌株在胃肠道适应性存活力,进行了耐胃酸、耐肠液、耐胆盐试验;为证明其抑菌能力,进行了革兰氏阳性、阴性菌抑制试验,阐明菌株的抗感染的性能;为验证B.subtilis在体内抑制病原菌的抗感染效果,以家兔为实验动物进行饲喂试验,显示其对兔生长性能、免疫球蛋白、免疫器官指数、肠道菌群、免疫应答以及抗细菌感染有显著作用,确认饲料添加益生菌能够代替抗生素,展示了良好的产业前景;为进一步揭示其抗感染的机制,通过检测NLRs以及下游免疫基因表达发现,B.subtilis可以通过激活兔NOD1(rNOD1)介导宿主抗细菌感染免疫应答。我们克隆了rNOD1,探究rNOD1介导的信号通路及其抑菌活性,并确定r NOD1在抗细菌感染过程中的作用。本研究分为以下4部分:1.枯草芽孢杆菌的分离鉴定和体外益生性能的评估本研究中,根据菌落形态、革兰氏染色镜检、生化试验、16S rRNA鉴定,我们从土壤中分离到具有典型火山口形状的革兰氏阳性B.subtilis 180株。所有菌株进行体外人工胃液、肠液、胆盐耐受试验后,筛选到68株耐受良好的B.subtilis。在此基础上,对68株菌进行功能性筛选,包括抑菌能力(产ESBL大肠杆菌、肠道致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌)和产酶活性试验。其中BYS2、BQ3、BD17在筛选的68株B.subtilis中对致病菌的综合抑制能力最强。B.subtilis对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌的抑制能力是最强的。尤其是对产气荚膜梭菌,抑菌圈直径能达到20-30mm。BYS2、BQ3、BD17对于金黄色葡萄球菌抑制圈直径都大于20mm,对沙门氏菌抑制能力稍弱,BQ3抑菌圈最高达到18.1±1.7mm,对大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)的抑菌圈直径12-14mm。而且对产ESBL大肠杆菌的也有相同的抑菌能力。最后进行抗生素敏感试验,确定其不携带耐药基因。最终,我们选择了3株抑菌能力最强(BYS2、BQ3、BD17)和2株产酶能力最强(BG5、BGY12)的B.subtilis进行体内饲喂实验,探究B.subtilis对机体的益生效果。2.体内评估枯草芽孢杆菌对机体生长性能、免疫调节及肠道菌群的影响饲喂10~6 CFU g~-11 B.subtilis组显著提高了新西兰大白兔的平均增重以及血清中免疫球蛋白IgG和IgA(P<0.05)。饲喂5周后,添加10~6 CFU g~-11 B.subtilis组与对照组相比,兔的胸腺和脾脏相对重量显著增加(P<0.05)。饲喂B.subtilis 5周和7周后,通过高通量测序对家兔盲肠内细菌16S rRNA V3-V4区进行分析。通过α多样性分析,饲喂B.subtilis后盲肠菌群的物种多样性高于对照组。对门水平物种进行分析,厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)占全部序列的95.0%-96.5%。Firmicutes的相对丰度在饲喂益生菌5周、7周后有上升的趋势,而Bacteroidetes的相对丰度饲喂益生菌5周、7周后显著下降(P<0.05)。肠道菌群在门水平的差异是属水平的变化引起的。对照组家兔盲肠菌群在属水平排名前十为瘤胃球菌属(Ruminococcus)8.13%、颤螺菌属(Oscillospira)4.62%、拟杆菌属(Bacteroides)5.20%、Akkermansia 3.46%、粪球菌属(Coprococcus)1.28%、梭菌属(Clostridium)1.12%、Faecalibacterium 0.59%、脱硫弧菌(Desulfovibrio)0.23%、Parabacteroides 0.38%、Dorea 0.39%。饲喂B.subtilis 5周后,家兔盲肠菌群在属水平排名前十为Ruminococcus 12.00%、Oscillospira 4.19%、Bacteroides 0.69%、Akkermansia1.18%、Coprococcus 0.76%、Clostridium 1.05%、Faecalibacterium 0.49%、Desulfovibrio0.20%、Parabacteroides 0.10%、Dorea 0.17%。饲喂B.subtilis 7周后,家兔盲肠菌群在属水平排名前十为Ruminococcus 9.61%、Oscillospira 7.50%、Bacteroides 1.57%、Akkermansia 0.65%、Coprococcus 2.54%、Clostridium 0.24%、Faecalibacterium 0.23%、Desulfovibrio 0.38%、Parabacteroides 0.21%、Dorea 0.05%。饲喂B.subtilis后促进肠道菌群平衡和肠道消化功能,维持肠道健康。其中,Ruminococcus是肠道中的重要菌群,有利于协助纤维素的消化与吸收。本研究中,Ruminococcus在饲喂B.subtilis 5周后,相对丰度显著增加(P<0.05)。Bacteroides在饲喂B.subtilis 5周、7周后相对丰度显著下降(P<0.05),Clostridium在饲喂B.subtilis 7周后相对丰度显著下降(P<0.05)。这一结果表明饲喂B.subtilis一定程度上促进肠道有益菌生长,抑制致病菌的生长。综上所述,饲喂B.subtilis后提高了兔生长性能、免疫球蛋白、免疫器官指数以及盲肠微生物菌群的多样性,促进肠道健康。3.枯草芽孢杆菌诱导的免疫应答以及提高机体抗病力本实验首次研究了B.subtilis对于兔先天性免疫应答的研究。为了研究饲喂B.subtilis后诱导的先天性免疫应答,在饲喂5周和7周后,采用荧光定量PCR的方法检测脾脏和空肠的免疫相关基因。饲喂B.subtilis后,模式识别受体NOD1、NLRC3、NLRX1表达上调。下游的促炎因子IL-1β、IL-8和IFN-γ以及β防御素表达量也都增加。饲喂7周后进行肠出血性大肠杆菌攻毒,饲喂B.subtilis组兔的存活率显著高于对照组(P<0.05)。而且,饲喂B.subtilis组兔盲肠内容物中的E.coli数量显著低于对照组(P<0.05)。饲喂B.subtilis组的NLRs和β防御素显著上调,尤其是DEFB114、DEFB134、DEFB135。而β防御素表达量的增加能够直接杀灭病原微生物,从而增强机体抗感染能力。另外,我们在体外将兔肾(RK-13)细胞与B.subtilis共培养后得到相似的结果。刺激B.subtilis后,RK-13细胞中的rNOD1以及下游促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和β防御素DEFB124、DEFB125、DEFB128表达量显著上调。但是,通过干扰RNA敲低rNOD1后,B.subtilis不能诱导促炎因子以及防御素的表达。这一部分结果表明了B.subtilis可以通过激活rNOD1诱导下游促炎因子以及β防御素的表达从而提高机体抗病力。因此我们接下来深入探究,B.subtilis激活rNOD1后诱导的下游信号通路。4.rNOD1介导的信号通路以及在大肠杆菌感染过程中的作用NOD1是NLRs中最重要的一员,在哺乳动物先天性免疫系统中是识别外源病原微生物以及内源性分子的细胞内受体。本试验以RK-13细胞的cDNA为模板,成功克隆rNOD1,rNOD1含有3个保守结构域:N端的CARD(caspase activation and recruitment domain)结构域,中间的NACHT结构域,C端的7个LRR(leucine-rich repeat domain)结构域。rNOD1在兔的各组织器官中广泛表达,在E.coli感染过程中,脾脏、肝脏和肾脏中rNOD1的表达量显著增加,表明机体能够迅速识别外来病原,并诱导抗感染免疫应答。过表达rNOD1后,能够激活NF-κB,并诱导下游促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α以及α防御素NP5和β防御素DEFB124、DEFB125、DEFB128、DEFB135表达。过表达rNOD1后显著抑制E.coli的增殖,相反,敲低rNOD1后,E.coli的增殖显著增加(P<0.05)。而抑制NF-κB后,rNOD1对E.coli的抑制能力丧失,且显著促进了E.coli的增殖(P<0.05)。表明,rNOD1通过激活NF-κB信号通路来介导其抑菌活性。进一步研究发现,过表达rNOD1后显著增加E.coli感染过程中诱导促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-γ及β防御素DEFB124、DEFB125、DEFB128的表达,但是敲低rNOD1后这些基因的表达都减少。而且抑制NF-κB后,rNOD1失去诱导下游促炎因子以及防御素的功能。综上结果表明,rNOD1通过激活NF-κB信号通路介导其抑制E.coli的免疫应答。另外,r NOD1与自噬蛋白LC3存在共定位的现象,过表达rNOD1后感染E.coli,自噬蛋白LC3-Ⅱ显著增加(P<0.05),表明rNOD1通过诱导自噬,在抑制E.coli感染中起重要作用。基于此,rNOD1及其配体iE-DAP将来可能发展为疫苗佐剂和药物开发的新靶点。