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目的:脊髓后角是伤害性信息传递的初级中转站,谷氨酸是脊髓后角初级感觉传入纤维及兴奋性中间神经元内最主要的神经递质。脊髓后角突触内谷氨酸稳态的维持对于伤害性信息的传递及痛觉过敏的形成至关重要。突触内谷氨酸的稳态依赖于谷氨酸释放和清除的平衡。突触间隙谷氨酸的清除主要依赖于高亲和力的谷氨酸转运体系统。其中,主要表达于星形胶质细胞上的胶质细胞谷氨酸转运体-1(glial glutamate transpor-1,GLT-1),承担着约90%的谷氨酸的摄取和清除。突触内谷氨酸的释放则主要取决于低亲和力的谷氨酸转运体系统——囊泡型谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporters,VGLUT)。被摄取入星形胶质细胞内的谷氨酸,通过谷氨酸-谷氨酰胺循环,再被运回至突触前神经末梢的胞质中,通过结合于突触囊泡膜上的VGLUT摄取并贮存于突触囊泡内,当突触活动时,通过胞吐的方式释放到突触间隙。目前,中枢神经系统内共克隆出3种VGLUT亚型,即VGLUT1、VGLUT2和VGLUT3。研究表明,GLT-1表达或功能的下调,参与多种疼痛模型中痛及痛过敏的形成和维持。因此,对GLT-1进行调制,可能成为神经病理性痛防治研究的新靶点。2005年,Rothstein等报道,β-内酰胺类抗生素,如头孢曲松钠(Ceftriaxone,Cef)等,可特异性地上调GLT-1的表达及其对谷氨酸的摄取。根据这一报道,我们前期的研究发现Cef可以通过上调大鼠脊髓后角GLT-1的表达,增强其对谷氨酸的摄取而发挥抗CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏的作用。但Cef上调GLT-1后,继续通过哪些深层次的机制影响CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏的形成和维持,尚有待进一步探讨。VGLUT与GLT-1共同维持着突触内谷氨酸的稳态,且在感觉和伤害性信息的传递中发挥着重要作用。但是,VGLUT各亚型在神经病理性痛中的作用尚不十分清楚。考虑到在共同维持突触内谷氨酸稳态的过程中,GLT-1通过谷氨酸-谷氨酰胺循环与VGLUT密切联系的重要特性,我们设想,Cef上调GLT-1表达后,可能通过影响突触前VGLUT的变化而影响伤害性信息的传递和痛觉过敏的形成,进而发挥抗慢性神经病理性痛过敏的作用。基于这一设想,本实验旨在观察Cef治疗后CCI大鼠脊髓后角VGLUT各亚型的表达变化及其与GLT-1之间的关系,以期为阐明Cef抗慢性神经病理性痛过敏的机制及GLT-1和VGLUT在神经病理性痛中的作用提供进一步的实验依据。方法:选用健康雄性Sprague-Dawley大鼠90只,体重290±20克,随机分为以下6组:(1)Naive组(n=6):正常大鼠,不做任何处理,取大鼠L4-L6节段脊髓后角,用Western blot检测GLT-1和VGLUT三种亚型的表达变化。(2)Sham组(n=30):仅暴露大鼠右侧坐骨神经但不结扎。于术前1 d、术后1 d、4 d、7 d、10 d、14 d、17 d、21 d观察大鼠热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值的变化;于术后1 d(n=6)、4 d(n=6)、7 d(n=12)和21 d(n=6)取大鼠L4-L6节段脊髓后角,用Western blot检测GLT-1和VGLUT三种亚型的表达变化。(3)CCI组(n=36):行大鼠右侧坐骨神经缩窄性损伤(chronic constriction injury,CCI)手术,于术前1 d、术后1 d、4 d、7 d、10 d、14 d、17 d、21 d观察大鼠热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值的变化;于术后1 d(n=6)、4 d(n=6)、7 d(n=12)、14 d(n=6)和21 d(n=6)取大鼠L4-L6节段脊髓后角,用Western blot检测GLT-1和VGLUT三种亚型的表达变化。(4)CCI+i.p.NS+i.t.DW(n=6):行大鼠右侧坐骨神经CCI术,于术后当天开始给大鼠腹腔注射生理盐水(normal saline,NS),0.72 ml/kg,每日一次,连续7 d。于第一次腹腔注射后72 h,给大鼠椎管内注射双蒸水(double distilled water,DW)10μl一次。于术前1 d、术后4 d、7 d观察大鼠热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值的变化;于CCI术后7 d取大鼠L4-L6节段脊髓后角,用Western blot检测GLT-1和VGLUT三种亚型的表达变化。(5)CCI+i.p.Cef+i.t.DW(n=6):行大鼠右侧坐骨神经CCI术,于术后当天开始给大鼠腹腔注射Cef,200 mg/kg,每日一次,连续7 d。余同CCI+i.p.NS+i.t.DW组。(6)CCI+i.p.Cef+i.t.AS-ODNs(n=6):行大鼠右侧坐骨神经CCI术,于术后当天开始给大鼠腹腔注射Cef,200 mg/kg,每日一次,连续7 d。于第一次腹腔注射后72 h,给大鼠椎管内注射GLT-1的反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,AS-ODNs)18 nmol一次。于术前1 d、术后4 d、7 d观察大鼠热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值的变化;于CCI术后7 d取大鼠L4-L6节段脊髓后角,用Western blot检测GLT-1和VGLUT三种亚型的表达变化。结果:1 CCI术后大鼠痛阈的变化以及脊髓后角GLT-1和VGLUT三种亚型的表达变化1.1 CCI术后大鼠痛阈的变化Sham组大鼠手术侧后肢的热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值在术后1 d、4 d、7 d、10 d、14 d、17 d、21 d与术前相比无显著变化。与sham组相比,CCI术后,大鼠出现了明显的热和机械性痛觉过敏,表现为从术后1 d起,大鼠的热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值开始降低(P<0.05),于术后4 d时降至最低值,并持续到所观测的21 d。1.2 CCI术后大鼠脊髓后角GLT-1和VGLUT三种亚型的表达变化我们首先观察了sham手术对GLT-1和VGLUT三种亚型的基础表达是否存在影响。Western blot结果显示,跟naive组相比,sham术后1 d、4 d、7 d、21 d大鼠脊髓后角GLT-1和VGLUT三种亚型的表达均无显著变化。因此,我们选用sham术后7 d的大鼠作为CCI组各时间点大鼠脊髓后角GLT-1和VGLUT三种亚型表达变化的对照。Western blot结果显示,与sham组相比,CCI术后4 d起,脊髓后角GLT-1蛋白的表达开始显著降低,并持续至所观察的21 d(P<0.05);CCI术后7 d起,脊髓后角VGLUT1蛋白的表达开始显著降低,并持续至所观察的21 d(P<0.05);CCI术后4 d起,脊髓后角VGLUT2蛋白的表达开始显著降低,并持续至所观察的21 d(P<0.05);CCI术后1 d起,脊髓后角VGLUT3蛋白的表达开始显著降低,并持续至所观察的21 d(P<0.05)。CCI术后,上述4种谷氨酸转运体蛋白表达降低的时间窗与痛觉过敏形成的时间窗一致,提示其可能参与CCI所致的慢性神经病理性痛过敏的形成和维持。2腹腔注射Cef对CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏的影响及其脊髓后角GLT-1和VGLUT三种亚型表达的影响2.1腹腔注射Cef对CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏的影响与CCI组相比,CCI+i.p.NS+i.t.DW组大鼠术后4 d和7 d手术侧后肢的热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值无显著变化。与CCI+i.p.NS+i.t.DW组相比,腹腔注射Cef后(即CCI+i.p.Cef+i.t.DW组),CCI术后4 d和7 d大鼠手术侧后肢的热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值显著增高(P<0.05)。而椎管内注射GLT-1 AS-ODNs 18 nmol后(即CCI+i.p.Cef+i.t.AS-ODNs组),CCI术后4 d和7 d大鼠手术侧后肢的热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值又重新降低(P<0.05),表明GLT-1AS-ODNs抑制了Cef对CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏的治疗作用。2.2腹腔注射Cef对CCI大鼠脊髓后角GLT-1和VGLUT三种亚型表达的影响Western blot结果显示,与sham组相比,CCI组大鼠术后7 d时,GLT-1、VGLUT1、VGLUT2和VGLUT3的表达均显著降低(P<0.05)。与CCI组相比,CCI+i.p.NS+i.t.DW组大鼠术后7 d时,GLT-1、VGLUT1、VGLUT2和VGLUT3的表达无显著变化。与CCI+i.p.NS+i.t.DW组相比,腹腔注射Cef后(即CCI+i.p.Cef+i.t.DW组),CCI术后7 d时,GLT-1、VGLUT1、VGLUT2和VGLUT3的表达均显著升高(P<0.05)。而椎管内注射GLT-1AS-ODNs 18 nmol后(即CCI+i.p.Cef+i.t.AS-ODNs组),CCI术后7 d时,GLT-1、VGLUT1、VGLUT2和VGLUT3的表达又重新降低(P<0.05),表明GLT-1 AS-ODNs抑制了Cef对CCI大鼠脊髓后角GLT-1、VGLUT1、VGLUT2和VGLUT3表达的上调。结论:VGLUT1、VGLUT2和VGLUT3的表达下调可能参与了CCI诱导的大鼠慢性神经病理性痛过敏的形成与维持;Cef通过调制GLT-1,进而上调VGLUT1、VGLUT2和VGLUT3的表达,发挥抗CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏的作用。