甜菊糖苷,一种贝壳杉烯型四环二萜类化合物,是天然甜味剂甜菊糖的主要成分之一,已被广泛应用于食品、饮料、医药等行业。早期研究表明,甜菊糖不但具有高甜低热的特性,同时还具有多种药理活性,如抗高血压、抗糖尿病、抗龃齿等。本文以甜菊糖主要成分莱鲍迪苷A(RA)、甜菊醇(SV)及其体内主要代谢物葡糖醛酸结合物(SVG)为研究对象,利用微粒体、重组酶、细胞、动物等实验模型,从体外、体内两方面阐明其代谢转运机制,同时基于代谢转运机制考察甜菊糖与药物合用时可能产生的潜在相互作用,为其安全合理应用提供依据。本研究首先建立了快速、灵敏的LC-MS/MS方法用于检测样品中SVG的含量。样品经乙腈沉淀蛋白处理后,使用C18色谱柱(2.3x50 mm,5μm)进行液相分离,在负离子MRM模式下检测SVG。线性范围为2-1000 nM,方法具有良好的重现性。为阐明SV在体内的代谢清除机制,我们利用肝微粒体和肠微粒体对SV的内在清除率进行了考察。首先,对蛋白浓度和孵育时间进行优化发现,蛋白浓度0.2 mg/ml和反应时间5 min最佳。在人、鼠肝微粒体和肠微粒体四种代谢体系中,SV均能快速发生葡萄糖醛酸结合反应生成SVG,且呈现明显的底物抑制现象。在人和大鼠中,SVG的生成速率相似,但肝微粒体中SVG生成速率显著高于肠微粒体,提示肝是SV发生葡萄糖醛酸化反应的主要器官。为进一步阐明SVG在体内的生成机制,本研究利用12种FDA规定的重组人UGT酶亚型进行底物筛查。结果表明,在苷元浓度为2 μM时,UGT2B7可介导SV快速发生葡萄糖醛酸结合反应,催化生成SVG;当苷元浓度升到20μM时,UGT2B7和UGT1A3均可显著介导SVG的生成。随后在两种重组酶中的动力学进行了考察。结果表明,与微粒体类似,在重组酶中同样出现了明显的底物抑制现象。提示UGT2B7是介导人体内SV发生葡萄糖醛酸化的主要二相代谢酶。本研究进一步地考察了人体主要外排转运体和摄取转运体是否参与SVG的处置过程。我们首先利用稳定表达hMDR1、hBCRP、hMRP2或hMATE1的MDCKⅡ细胞进行双向转运实验。结果显示,这些外排转运体对SVG的跨膜转运无明显作用。随后,我们利用稳定表达摄取转运体hOAT1、hOAT3、hOCT2、hOATP1A2、hOATP1B1、 hOATP1B3或hOATP2B1的HEK293细胞系进行考察。结果表明,hOAT3及hOATPs对SVG的细胞摄取起重要作用,且hOAT3对SVG的排泄作用远高于hOATPs,提示hOAT3是介导SVG体内转运清除的主要转运体。为了进一步研究是否存在SV与药物的相互作用,我们对SV与药物或天然小分子化合物之间的相互作用进行了考察。结果发现,UGT2B7的底物齐多夫定、氟哌啶醇、双氯芬酸对SVG生成均有不同程度的抑制作用,其中以双氯芬酸的抑制作用最强,Ki为4.2μM,属于竞争性抑制。并且,SV可反作用于双氯芬酸,抑制其代谢清除。提示SV与双氯芬酸之间可能存在UGT2B7介导的相互作用。基于转运体介导的相互作用研究发现,多种药物和天然小分子化合物可显著抑制SVG的细胞摄取,尤其是hOAT3及hOATP1B3介导的细胞摄取。其中,抑制作用最强的是槲皮素、替米沙坦、双氯芬酸和桑皮黄素,对hOAT3的摄取抑制作用IC50值分别为1.82μM、2.92 μM/8.01μM和9.97μM。在大鼠原代肝细胞中的研究表明,SVG可显著被原代肝细胞摄取,替米沙坦及桑皮黄素可显著抑制这一过程,且具有明显的浓度依赖性,IC50值分别为2.0μM和7.1μM。大鼠体内相互作用研究发现,同时灌胃给予大鼠RA (15mg/kg)和替米沙坦(8 mg/kg)后,替米沙坦可显著升高体内SVG的暴露量和最大血药浓度,但对RA没有明显作用。综上所述,本研究发现食用甜菊糖后,胃肠道生成的SV主要在肝脏通过UGT2B7介导生成葡萄糖醛酸化代谢产物SVG,随后SVG通过转运体hOAT3和hOATPs转运,主要经肾脏排出体外。本研究首次阐明了甜叶菊提取物特别是莱鲍迪苷A(RA)食用后的代谢转运机制,同时发现多种药物或天然化合物可以产生基于代谢转运机制的SV-药物相互作用。鉴于大多数植物有效成分以糖苷形式存在于自然界,其代谢过程主要包括胃肠道水解、一相及二相代谢,本论文的研究思路和成果为甜菊糖的临床合理、安全应用(如糖尿病病人血糖控制等)提供了科学依据。