一、研究背景组蛋白去乙酰化酶(HDACs)是一类催化组蛋白去乙酰化作用的蛋白酶,它能使核染色质变得更加紧密,从而抑制基因转录。目前,已经发现的人源的HDACs共有18个亚型,被分为4个亚族。HDACs通过对组蛋白和非组蛋白的去乙酰化来影响各种细胞功能。HDACs的突变和异常表达会导致多种疾病的发生,尤其是肿瘤,这使HDACs成为了重要的抗肿瘤靶点,越来越多的HDACs抑制剂(HDACIs)被开发出来用于肿瘤的治疗。它们的抗肿瘤作用主要通过调节基因转录、DNA损伤修复、细胞凋亡及周期、新陈代谢和血管生成等来实现。迄今为止,已经有五个HDACIs被批准上市,分别为Vorinostat (SAHA)、Romidepsin(FK228)、Belinostat (PXD-101)、Panobinostat (LBH-589)和Chidamide,临床上用于皮肤T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤的治疗。此外,还有二十余种HDACIs处于临床研究阶段。绝大多数的HDACIs的结构都符合经典的药效团模型,该模型主要分为三个部分：与酶表面相互作用的识别基团(cap)、深入酶底端的Zn2+螫合基团(ZBG)及将这两个部分连接起来的疏水性长链(linker)。本研究论文结合临床上或研究中的已知HDACIs的优势结构和HDACs酶活性中心结构特点,设计、合成了全新骨架的HDACIs,并对其药效团模型三个部分进行不断地改造和结构优化,最终得到了高效、高选择性的HDACIs。二、对位取代的N-羟基肉桂酰胺类HDACIs的设计、合成及抗肿瘤活性研究我们结合处于临床研究阶段或者已经上市的HDACIs PXD101、LBH589和SB939的结构特点,以N-羟基肉桂酰胺为linker和ZBG,并且在cap中引入吲哚结构,经过几轮的结构优化及改造,设计和合成了一系列具有全新骨架的HDACIs共32个。化学结构经过’HNMR和HRMS确证,化合物纯度经HPLC检测大于95%。我们以Hela细胞核提取物(主要含HDAC1和2)为酶源对这一系列化合物进行了抑酶活性测定,结果显示,绝大多数化合物的体外抑酶活性明显高于阳性对照药SAHA,活性最好的化合物ICso值达到了低纳摩尔级。化合物llr对HDAC1和HDAC3的IC5o值分别为11.8 nM和3.9 nM,而对HDAC 2、4、6、8.11均在微摩尔级或者亚微摩尔级,表现为HDAC1/3双选择性。迄今为止,绝大多数临床上的class Ⅰ选择性HDACIs均为邻苯二胺类,尚未有此类亚型选择性的异羟肟酸类抑制剂的报道。此外,化合物11e、11p、11r、11w和lly对多株实体瘤和血液瘤细胞显示出很强的抗增殖活性,ICso值比SAHA低了一个数量级。化合物11e、11r、11w和1ly明显增强了乙酰化组蛋白H3和H4的表达水平,与体外抑酶活性结果相一致。同时,代表性化合物使pro-caspase3的表达水平明显降低,这与促肿瘤细胞凋亡实验结果相一致。化合物llr在U937裸鼠荷瘤模型中显示出口服有效性。三、间位取代的N-羟基肉桂酰胺类HDACIs的设计、合成及抗肿瘤活性研究上一个系列中对位取代的肉桂酰胺类HDACIs有着很强的体内外抗瘤活性,并且具有突出的HDAC1/3选择性,因此我们对其进行了进一步的结构改造。我们观察临床上和已经上市的含有肉桂酰胺基团的HDACIs,发现肉桂酰胺苯环上的取代基团处于不同的位置,比如LBH589是对位取代,而PXD1o1则是间位取代。因此我们设计了一系列间位取代肉桂酰胺类HDACIs,共计18个化合物,化学结构经过1HNMR、13CNMR和HRMS确证,均未见其他文献或专利报道。我们也以Hela细胞核提取物为酶源测定化合物的体外抑酶活性,结果显示化合物都具一定的HDACs抑制活性,其中化合物29m、29q和29r活性明显高于阳性对照药SAHA。HDACs亚型选择性测定实验结果表明代表性化合物29k为广谱的HDACIs。另外,化合物29k表现出良好的体外抗肿瘤细胞增殖活性和促凋亡活性。裸鼠体内抗肿瘤细胞增殖活性结果表明,化合物29k是一个口服有效的HDACI。值得一提的是,间位取代肉桂酰胺类异羟肟酸HDACIs的抑酶活性和选择性均弱于对位取代的抑制剂。四、N-羟基苯甲酰胺类HDACIs的设计、合成及初步活性研究在我们之前的研究中,以N-羟基苯甲酰胺为linker和ZBG结构的HDACIs表现出良好的HDACs抑制活性,这说明N-羟基苯甲酰胺基团可以作为活性片段应用在HDACIs设计中。因此在本系列化合物中,我们引入了N-羟基苯甲酰胺基团,并且沿用了第二章和第三章化合物cap中的吲哚结构,共设计合成了27个HDACIs,化学结构经过1HNMR、13CNMR和HRMS确证,均未见其他文献或专利报道。在这些化合物中,36q-36v对HDACs的ICso值达到了低纳摩尔级(1.5-13.0nM),抑制活性远远高于阳性对照药SAHA,而化合物36r对多种肿瘤细胞的体外抗增殖活性则只是略高于SAHA,我们猜测这是因为36r具有较差的细胞跨膜性,这一推测在细胞内HDACs class Ⅰ抑酶活性实验结果中得到了证实。此外,36r和361的细胞内HDACs class Ⅱa抑制活性与HDACs class Ⅰ抑制活性相当,这说明这两个化合物有可能是广谱HDACIs。通过结构改造和药物剂型手段提高此系列化合物跨膜性,以进一步增强其抗肿瘤活性,是此系列化合物继续开发的重点。五、含有吲哚的邻苯二胺类及硫醇类组蛋白去乙酰化酶抑制剂的设计、合成及初步抗肿瘤活性研究第一个系列中我们介绍了N-羟基肉桂酰胺类HDAC1/3双选择性抑制剂的发现,但是,由于异羟肟酸对锌离子有着非常强的螫合作用,上述异羟肟酸类HDACIs不可避免的对HDAC2、HDAC8和HDAC6等其他亚型也存在一定的抑制作用。所以,我们试图使用其他的螯合基团来替代羟肟酸,以增强抑制剂的选择性。据我们所知,临床上绝大多数的class Ⅰ选择性抑制剂均是以邻苯二胺为螯合基团的,比如MS-275、MGCD0103、CI994和RG2833。因此,我们保持了第二章所述的代表性HDAC1/3选择性抑制剂lly的cap结构(或者cap和linker)不变,引入上述class Ⅰ选择性抑制剂的linker和锌离子螯合基团,得到了新的邻苯二胺类HDACIs。另外,一些以巯基为螯合基团的HDACIs也显示出了class Ⅰ的选择性,因此,我们也设计了硫醇衍生物类HDACIs.之前有研究报道,在邻苯二胺类HDACIs螯合基团邻苯二胺裸露氨基的对位引入芳环或芳杂环结构会降低化合物对HDAC3的抑制作用。而在裸露氨基的间位引入F原子会降低化合物的HDAC1的作用从而得到HDAC3选择性抑制剂。所以,我们对邻苯二胺类HDACIs的螯合基团进行了结构改造,以得到更多的选择性属性。在这一章中我们共设计合成了24个活性化合物,化学结构经过’HNMR和HRMS确证,均未见其他文献或专利报道。绝大多数邻苯二胺类化合物均表现出HDAC抑制活性,但是巯酯和二硫化合物在10μM的浓度下并未表现出抑制活性。化合物43b表现出最好的HDAC抑制活性、HDAC1选择性和有效的体外抗增殖活性。体内研究证实43b对白血病细胞U937和结肠癌细胞HCT116荷瘤模型均表现出良好的口服抗癌活性。尽管43b的活性略差于阳性对照药MS275,但是43b对受试裸鼠并未表现出毒副作用,显示出43b有更好的耐受性。新合成的噻吩基和苯基化合物72a、72b、84a、84b和84c表现出很强的HDAC.1/2双选择性。氟取代化合物78表现出中等程度的]3DAC3选择性。令人失望的是,新合成的HDAC1/2选择性抑制剂的抗增殖活性较差。我们通过比较化合物84c和43b的细胞内液浓度得出化合物跨膜性的改变有可能为其细胞活性差的原因。因此,改善细胞跨膜性是我们这一系列化合物今后研究的重点。六、全文总结与展望本研究论文以Zn2+依赖性的HDACs为靶标,综合运用药物化学、生物化学及计算机化学等前沿学科,结合临床上或研究中的已知HDACIs的优势结构,合理设计并合成了四个系列共100余个具有全新骨架结构的HDACIs,并对化合物进行了分子和细胞水平抑酶活性测定(包括亚型选择性测定)、细胞水平和动物水平的抗肿瘤活性测定。利用得到的构效关系及亚型选择性信息对化合物进行逐步的结构改造和优化,得到了具有高选择性、高抗肿瘤活性的化合物,尤其是HDAC1/3双选择性的异羟肟酸类抑制剂11r,是我们对此类抑制剂的首次发现,之前未见有文献报道,这也为异羟肟酸类选择性抑制剂的发现提供了新的方向。对化合物llr的进行进一步的结构优化,以得到选择性更强,活性更好的化合物是我们接下来的研究重点。另外,基于HDACs的多靶点药物的出现也为我们今后的研究提供了新的思路。除了抗肿瘤活性研究之外,HDAC1/3选择性抑制剂对神经系统多聚谷氨酰胺疾病的活性也正在找相关实验室协作进行。