研究背景和目的:蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是通常由颅内动脉瘤破裂引起的临床常见脑血管意外。由于其发病青睐青壮年人群,加之引起的致死致残率居高不下、临床治疗效果欠佳,给社会经济和家庭生活带来了极为沉重的负担。近十年来的研究表明,蛛网膜下腔出血高死残率的主要归因于SAH后继发的早期脑损伤(Early brain injury,EBI)。故而,针对SAH后EBI病理致损机制展开研究,预期筛选新的有效的治疗靶标,以期提高临床患者的神经功能预后,具有极为现实的社会意义。早期脑损伤是蛛网膜下腔出血后早期(72小时内)发生的一系列复杂的病理生理机制,包括颅内压(Intracranial pressure,ICP)升高、灌注压(Cerebral perfusion pressure,CPP)下降、脑血流(Cerebral blood flow,CBF)下降、脑积水、离子稳态失衡、细胞死亡、血脑屏障破坏、脑水肿等,最终导致脑微循环灌注不足,引起微循环障碍。微循环障碍导致的脑缺血缺氧损伤是蛛网膜下腔出血后最严重的并发症。微血栓形成、微血管痉挛、脑血流自调节下降等促成微循环障碍,其中,微血管痉挛表现为管壁增厚、管腔狭窄、红细胞流动受阻,直接阻碍脑组织血供,导致脑缺血缺氧损伤。因此,缓解蛛网膜下腔出血后微血管痉挛是减轻微循环障碍,降低早期脑损伤,降低死残率的一条有效途径。周细胞是一类多能性细胞,在中枢神经系统内,其主要定植于微血管基膜周边,通过对微循环血管进行调控,进而参与完整血脑屏障的维持或参与生理病理条件下脑组织微血管的再生作用。近年来,周细胞在病理条件下调控微循环的作用得到重视。研究表明,周细胞在缺氧或者电刺激下诱发微血管收缩,阻断红细胞流动,导致微循环障碍。周细胞在高血压、脑缺血、心肌梗塞等疾病的微循环调节中发挥了重要作用,这可能与周细胞表达一些肌动蛋白(如α-SMA)具有收缩功能有关,但是周细胞在蛛网膜下腔出血中的作用仍然缺乏研究。此外,在SAH后脑血管痉挛及微循环调节过程中,内皮型一氧化氮合酶(eNOS)在众多调控因子中发挥重要的作用。e NOS源性的一氧化氮(NO)信号系统是调节脑血流动力学的重要机制。已有研究表明,一氧化氮含量可激活周细胞介导的炎症反应,且能被蛛网膜下腔出血后释放的血红蛋白清除,提示周细胞可能通过响应一氧化氮信号,发生表型转换,调节血管功能。因此我们推测,蛛网膜下腔出血后一氧化氮信号被抑制,激活周细胞的表型转换,周细胞介导微血管痉挛,进而导致微循环障碍,最终引起蛛网膜下腔出血后早期脑损伤。为了验证上述假说,本研究分二部分进行。第一部分采用颈内动脉线栓刺破法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型,分别给予enos抑制剂l-nna以及其激动剂scutellarin,活体观察微血管痉挛,免疫荧光检测周细胞表达,在体观测干预后对大鼠死亡率、体重、神经功能缺损、脑组织含水量、血脑屏障通透性损害的影响,并通过he及免疫组化染色检测蛛网膜下腔出血后血红蛋白的分布。通过第一部分的在体实验明确周细胞是否介导了蛛网膜下腔出血后微血管痉挛,进而恶化了微循环,明确scutellarin干预enos源性的no后是否缓解微血管痉挛,减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤。第二部分通过建立大鼠脑周细胞培养体系和脑片微循环研究模型,用血红蛋白处理脑片和细胞,再用一氧化氮清除剂ptio以及其缓释剂deta/no进行干预,脑片模型观测干预后微血管在周细胞处收缩的情况;在各时相点,采用rt-pcr检测周细胞α-sma核酸转录水平、wb检测其蛋白表达变化。通过第二部分的离体实验进一步明确血红蛋白诱导的一氧化氮信号抑制在周细胞表性转换以及微血管痉挛中的作用。方法:第一部分(在体):采用血管内穿刺法,建立了sd大鼠蛛网膜下腔出血模型;将动物随机分为4组:假手术组(sham)、蛛网膜下腔出血组(sah+vehicle)、l-nna干预组(sah+l-nna)以及scutellarin干预组(sah+scutellarin)。1、活体荧光成像检测大鼠脑表层微血管痉挛及微循环障碍情况;2、分别测定大鼠体重变化、死亡率、出血量、脑组织含水量、神经功能缺损、血脑屏障通透性变化;3、生化检测脑组织enos活性及no含量,wb检测一氧化氮合酶各亚型蛋白表达;4、组织学检测:免疫荧光检测sah后周细胞pdgfrβ及α-sma表达;免疫组化及h&e染色检测sah后血红蛋白的分布;第二部分(离体):为了直接观测血红蛋白对微血管痉挛的作用,建立大鼠脑片模型,并分别用人工脑脊液、血红蛋白、ptio、l-nna以及deta/no灌流脑片;为了观察血红蛋白和no信号对周细胞α-sma表达的影响,建立大鼠脑周细胞离体培养模型,并将细胞分为4组:空白对照组(control)、血红蛋白处理组(hb)、ptio干预组(hb+ptio)、deta/no干预组(hb+deta/no)。1、用不同药物处理脑片后,正置红外显微镜下观测微血管收缩,及局部微循环变化;2、采用wb及rt-pcr检测各组周细胞α-sma蛋白及mrna表达;3、生化检测各组培养液一氧化氮含量;4、分别用hb及ptio孵育细胞0h、3h、6h、12h,采用wb及rt-pcr检测各组周细胞α-sma蛋白及mrna表达;5、ptio预处理细胞6小时后,再用不同浓度(0mm、0.1mm、1mm、10mm)deta/no及8-br-cgmp孵育细胞3小时,wb检测周细胞α-sma表达;结果:第一部分(在体):1、蛛网膜下腔出血后3小时,观察到脑皮层微血管痉挛,微循环障碍。给予scutellarin干预后微血管痉挛的数量及程度都得以缓解,给予l-nna处理后,微血管痉挛加重;2、蛛网膜下腔出血后各组体重、出血量变化无明显差异;scutellarin可以减轻大鼠sah后的神经功能缺损,缓解脑水肿程度,降低血脑屏障通透性损害。l-nna加重sah大鼠神经功能障碍,对脑组织水肿程度,血脑屏障通透性无显著影响。3、蛛网膜下腔出血后enos蛋白的表达及活性下降,一氧化氮含量减少。scutellarin能特异性的上调enos表达,升高其活性,缓解sah后一氧化氮的急剧下降。给予l-nna处理后进一步降低sah大鼠脑组织enos表达及活性,加剧sah后一氧化氮的下降;4、大鼠蛛网膜下腔出血后血红蛋白释放,在早期(6小时)就可侵入脑实质。同时,周细胞pdgfrβ和α-sma在蛛网膜下腔出血后表达也增强;第二部分(离体):1、血红蛋白诱导脑片微血管痉挛,收缩发生在周细胞样细胞处。deta/no和脑脊液灌洗均能缓解血红蛋白导致的微血管痉挛。单独用ptio和l-nna灌流脑片也能在微血管周细胞样细胞处诱发收缩。2、血红蛋白诱导周细胞α-sma表达增强。一氧化氮缓释剂deta/no干预可阻断血红蛋白的作用。给予一氧化氮清除剂ptio后进一步增强α-sma表达。3、血红蛋白及PTIO均能使培养液中的一氧化氮含量显著下降,DETA/NO能逆转血红蛋白诱导的一氧化氮浓度降低。4、血红蛋白及PTIO使周细胞α-SMA蛋白及m RNA表达在12小时内上调。5、诱导PTIO清除培养液中的一氧化氮后,给予一氧化氮缓释剂DETA/NO或者c GMP类似物8-Br-cGMP均能下调周细胞α-SMA表达。结论:1.蛛网膜下腔出血后早期e NOS表达及活性降低,NO浓度下降,周细胞表型转换,微血管痉挛以及微循环障碍。2.Scutellarin通过上调e NOS表达及活性,升高NO浓度,缓解SAH后微血管痉挛及早期脑损伤。3.血红蛋白在SAH后早期侵入脑实质,通过清除NO,抑制NO/cGMP信号,上调周细胞α-SMA的表达,诱导微血管痉挛。4.NO缓释剂DETA/NO能升高NO含量,阻断血红蛋白诱导的周细胞α-SMA表达上调,缓解微血管痉挛。