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哺乳动物大脑皮层是由高度有序的六层细胞排列而成,其有序的排列对维持其结构的完整性和功能的发挥具有重要意义。大脑皮层的发育包括神经元的增殖和分化,神经元迁移到皮层中的正确位置以及神经元的成熟和纤维联系的建立。许多遗传因素会影响大脑皮层的发育,造成大脑发育畸形并导致各种疾病,如:智力障碍、癫痫、平滑脑、小脑症以及巨脑症等。在人类大脑发育的早期PI3K-Akt3信号通路的异常激活会导致半侧巨脑症或巨脑症,然而目前对其致病机制仍然了解较少。Akt3特异性表达于神经系统,Akt3敲除小鼠表现为脑部特异性生长障碍,但结构正常。Akt3表达量的升高或是Akt3的突变而导致蛋白活性增高与多种肿瘤的发生以及大脑发育异常有关。为了深入研究A kt3的表达异常对神经系统发育的影响,我们运用细胞培养及转染,超表达载体构建,点突变载体构建、子宫内电击转染及免疫荧光染色等技术研究了Akt3在大脑皮层发育中的作用。主要研究结果包括:1.成功克隆了Akt3基因并构建Akt3超表达载体,运用脂质体转染中国仓鼠卵巢(C HO)细胞,发现Akt3超表达能促进CHO细胞板状伪足的形成。2.运用子宫内电转技术,我们在发育中(E15.5)的小鼠大脑皮层神经元中超表达Ak t3,发现Akt3会显著抑制神经元的迁移,促进顶树突的分支,影响了神经元胞体和胞核的大小,引起迁移中的神经元胞体上产生基树突,以及促进神经元轴突的生长。3.运用点突变技术,成功构建了Akt3的激活型点突变载体Akt3-E17K,我们将Akt3-E17K电转到小鼠大脑皮层中,发现Akt3-E17K不但抑制了神经元的迁移,而且还促使神经元发生聚集。其对神经元胞体大小、顶树突分支、基树突的产生以及轴突的生长等方面的影响与Akt3-wt类似,都具有促进作用。这表明增强Akt3的活性,能进一步加强其对神经元细胞骨架的调节作用。4.为了研究Akt3的磷酸化调节位点T305在大脑皮层发育中的功能,我们构建了Akt3-T305A点突变载体。子宫内电转结果表明Akt3-T305A突变明显抑制了Akt3的活性,其对神经元迁移的抑制作用部分解除;同时对顶突起的分支的影响,对胞体大小和基树突生长的影响也较小;对神经元轴突的生长的促进作用也明显减弱。5.我们通过软件对Akt3的结构进行分析发现D271可能为其蛋白激酶活性中心,为了研究D271是否对Akt3的活性发挥具有重要作用,我们构建了Akt3-D271A突变体并进行子宫内电转实验。结果显示Akt3-D271A突变体完全解除了Akt3对神经元迁移的抑制作用,对轴突生长、胞体大小和神经元的形态等方面的影响也明显减小,这表明Akt3的D271确实作为其活性中心,并在调控神大脑皮层发育过程中具有重要作用。