随着社会经济的发展和人们环保意识的提高,环境友好型生物源杀虫剂的应用受到越来越高的重视。利用昆虫病原真菌加工而成的真菌杀虫剂的应用及基础研究得到了长足的发展,但由于存在击倒昆虫时间较长、对环境条件要求高等缺点,真菌杀虫剂的广泛应用受到限制。因此利用基因工程和细胞工程等技术提高菌株毒力,遗传改造获得适合市场需要的真菌杀虫剂具有重要的应用价值。球孢白僵菌（Beauveriabassiana）作为重要的昆虫病原真菌在害虫的生物防治中发挥着重要作用。本文以球孢白僵菌作为出发菌株,同时引入双价毒力基因,即降解昆虫体壁的类枯草杆菌蛋白酶基因Pr1A和北非蝎（Androctonus australis）昆虫特异性神经毒素多肽基因AaIT,构建了高毒力双价工程菌株。为了获得双价工程菌株,本实验首先构建了含有不同筛选标记和目的基因的载体pGPS3Ben-Pr1A和pGPET1。并且通过对分生孢子的抑制性实验,筛选出两种抗性药对球孢白僵菌的最佳抑制浓度,其中草胺磷对球孢白僵菌的最佳抑制浓度为100μg/ml,苯菌灵对球孢白僵菌的最佳抑制浓度为2μg/ml。本实验选用了两种不同的遗传转化方法对球孢白僵菌进行遗传改造,获得了一价工程菌株Bb13T和Bb202T,及二价工程菌株Bb13Tpr1A。RT-PCR和Western blot结果证明,Pr1A和AaIT均在重组菌株中组成性转录和表达。PR1A蛋白酶活性测定结果表明,超表达PR1A的二价工程菌株的酶活相对于野生型菌株得到了极大的提高。并且通过初步的注射虫体实验,筛选出毒力相对较高的一价工程菌株Bb13T-4-1、Bb13T-10-3和Bb202T-7,和二价工程菌株Bb13TPr1A-1、Bb13TPr1A-2和Bb13TPr1A-3。对松墨天牛（Monochamus alternatus）的生物测定结果表明,超量表达AAIT的一价工程菌株Bb202T-7提高了杀虫效率约11.1%。使用大蜡螟（Galleria mellonella）和马尾松毛虫（Dendrolimus punctatus）进行生物测定的结果同样显示,超量表达AaIT单价基因及AaIT和pr1A双价基因均能显著地提高重组菌株的毒力。用大蜡螟做生测试虫,在孢子浓度为1×10⁷个/ml时,与野生型菌株Bb13相比,超量表达AaIT的重组菌株Bb13T的致死中时(LT₅₀)平均缩短了24.4%,同时超量表达AaIT和pr1A双价基因的Bb13TPr1A的LT₅₀平均缩短了20.9%。马尾松毛虫的生物测定中,在孢子浓度为1×10⁷个/ml时,与野生型菌株Bb13相比,超量表达AaIT基因的重组菌株Bb13T的LT₅₀平均缩短了40%,其致死中浓度(LC₅₀)降低了约15倍的剂量;超量表达AaIT和Pr1A双价基因的Bb13Tpr1A的LT₅₀平均缩短了36.7%,同时Bb13TPr1A的LC₅₀也降低了约8倍剂量。蛋白酶抑制实验及Western blot结果证明PR1A对AAIT有降解作用。并且生物测定结果表明,二价菌株的杀虫效率低于一价菌株的杀虫效率,更充分证明了PR1A对AAIT具有降解作用。因此在以后构建多价工程菌株时,首先要充分分析蛋白之间的相互作用以选出最佳的基因组合。