论文部分内容阅读
树突状细胞（DCs）是体内功能最为强大的专职抗原递呈细胞（APCs），直接调节机体免疫应答和免疫耐受之间的平衡。DCs的双向调节功能与自身发育的不同阶段以及表面FcγR表达类型密切相关。FcγR参与DCs分化、成熟以及免疫效应主要由自身激活型基序（ITAM）和抑制型基序（ITIM）所决定。基质交感分子-1（STIM1）是近年发现的Ca2＋通道调节蛋白，堪称细胞内质网上侦测钙离子含量的感应器，是“填充式Ca2+涌入理论”体系中的重要分子，具有潜在有效调节DCs免疫功能的作用。基质交感分子-2（STIM2）是调控基础Ca2+流入的主要分子，在Ca2＋通道应答的后期阶段扮演重要角色。Ca2+的流动不但参与调节T、B等免疫细胞的功能，同时也是细胞表面免疫受体胞内共有的ITAM和ITIM发挥激活和抑制功能的主要元素。由于FcγRs发挥功能是通过胞内ITAM和ITIM引起Ca2+的流动实现，而Ca2+的流动本身可能是影响DCs分化成熟的重要环节。因此，探索STIM1和STIM2在FcγRs调控DCs分化成熟中的作用对阐明DCs的免疫调节机制，发掘DCs调控免疫反应的靶点有重要的科学意义。目的：通过探讨STIM1及STIM2在FcγR调控树突状细胞成熟中的作用，阐明STIM1和STIM2在DCs发挥免疫调节中的作用。方法：1. DCs体外培养体系的建立采用密度梯度离心法，分离人外周血单个核细胞（PBMC）利用单核细胞贴壁特性，获取单核细胞。采用重组人白细胞介素-4（rhIL-4）100ng/mL联合重组人粒细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）100ng/mL刺激6天收获未成熟DCs（iDCs）；第6天加入脂多糖（LPS）1μg/mL刺激24h后收获成熟DCs（mDCs）。采用倒置相差显微镜观察DCs的形态变化，流式细胞仪鉴定DCs表型。2.激活FcγR对STIM1和STIM2表达的影响流式细胞仪和免疫荧光检测DCs表面激活型受体FcγRⅡa和抑制型受体FcγRⅡb的表达；Real-time PCR和Western-Bolt检测iDCs和mDCs中STIM1和STIM2的表达差异；分别采用IV.3和7.3与F（ab’）2结合形成免疫复合物，分别交联DCs表面激活型和抑制型FcγR后，使用Real-time PCR和Western-Bolt检测交联3min和30min后，细胞内STIM1和STIM2的表达差异。3. STIM1和STIM2的RNA干扰体系建立及鉴定采用化学法合成siRNA，通过脂质体Lipofectamine2000包囊siRNA后，将其递送进入DCs，采用Real-time PCR技术检测转染效果，MTT法检测转染24h后细胞活性。4.调节STIM1和STIM2的表达对DCs成熟的影响采用siRNA技术分别沉默DCs中STIM1和STIM2的表达，再分别用LPS刺激或交联激活型受体FcγRⅡa，流式细胞仪检测DCs的表型变化。结果：1.未成熟DCs中度表达CD32b（7.3）（57±7.1）%，DCs成熟后CD32b表达降低（22±2.1）%，CD32a （IV.3）在iDCs和mDCs中表达未见明显变化，分别为（43.9±4.3,48±2.8）%。2. DCs高表达STIM2，而DCs成熟后STIM2的表达明显降低（P<0.05）。STIM1随DCs成熟表达量未见明显变化。采用RNAi技术可以有效抑制STIM1和STIM2的表达，其抑制率分别为70.1%和65.8%，且对DCs活性无明显影响，DCs存活率分别为（94.17±12.38）%和（97.17±5.07）%。沉默DCs内STIM1和STIM2，采用LPS刺激24h，DCs的成熟状态未见明显变化，仍高表达CD80、CD86、HLA-DR、CD40、CD83。3.交联DCs表面激活型和抑制型FcγR3min，STIM1和STIM2的mRNA表达未见明显变化，然而交联抑制型受体FcγRⅡb30min，STIM1和STIM2表达明显增高（P<0.01），交联FcγRⅡa30min STIM1和STIM2mRNA和蛋白表达均明显降低（P<0.01），且无论单独或共同沉默STIM1和STIM2，激活FcγRⅡa均可导致DCs出现特殊成熟状态，高表达CD80、HLA-DR、CD40，中度表达CD86，但CD83表达量较低。结论：1. DCs同时表达STIM1和STIM2，iDCs高表达STIM2，但随DCs成熟其表达量明显降低；STIM1随DCs成熟表达量未见明显变化。2.沉默STIM1/STIM2的表达，DCs仍可被LPS诱导成熟。3. FcγR的激活与STIM1和STIM2的表达密切相关，激活FcγRⅡb上调STIM1和STIM2的表达；激活FcγRⅡa下调STIM1和STIM2的表达。4. FcγRⅡa可诱导DCs出现特殊成熟的表型，但不依赖于STIM1和STIM2的表达。