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目的:hTERT(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)即人端粒酶逆转录酶,是一个核糖核蛋白聚合酶。在预防染色体末端变短、维持染色体稳定、染色质修复、保证染色体在正常体细胞中复制的潜力以及细胞衰老等方面发挥着重要作用。其在正常体细胞中通常低表达。一旦异常表达,则往往与肿瘤形成密切相关。大量研究表明,hTERT在肺癌、肝癌、前列腺癌、鼻咽癌、结肠癌等癌症均存在高表达,并对肿瘤耐药性、肿瘤预后具有重要意义。有研究表明,SP1、c-Myc、STAT3和Akt参与调控hTERT转录及转录后水平表达,并影响前列腺癌的增殖、凋亡等生理过程。hTERT mRNA水平可以作为鼻咽癌患者早期诊断指标以及治疗靶点,通过放/化疗手段降低hTERT mRNA后,鼻咽癌患者生存状况也随之得到改善,表明hTERT是鼻咽癌发展的重要因子。研究发现,在hTERT高表达的肿瘤组织或细胞中,hEST2(端粒酶催化亚单位基因)也同样高表达。因此,hEST2可能是hTERT的活化子,并且在细胞永生化和肿瘤发生过程中发挥关键作用。还有研究发现,长期高水平表达细胞周期调节因子MCRS2,会导致细胞hTERT活性抑制以及端粒长度逐渐变短,表明hTERT可能参与了细胞周期调控过程。PI3K/Akt信号通路与细胞增殖密切相关,且被证明在肿瘤细胞中被激活。细胞内PI3K/Akt通路可以作为hTERT的上游调控hTERT的表达,有研究表明,通过一个正反馈调节通路,hTERT也可以反馈调节PI3K/Akt信号通路。还有报道称,相较于具有hTERT表达的正常细胞,hTERT基因启动子的活性在具有hTERT表达的肿瘤细胞中表现出高水平激活。因此,hTERT在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。由于基因调控的复杂性和肿瘤发病机制的多样性和不确定性,hTERT必然还存在其它调控因子。本文拟通过研究在结肠癌中发现新的hTERT转录调控因子,并研究其在hTERT转录调控中的作用机制,以及对于肿瘤发生发展和临床治疗的意义。方法:(1)在结肠癌细胞株中,利用新型生物素-链霉亲和素启动子垂钓系统,分离并鉴定验证新的hTERT启动子结合蛋白。(2)应用真核生物基因转染和干扰siRNA技术特异性的抑制hTERT启动子结合蛋白的表达,并通过体内外实验研究hTERT结合蛋白调控hTERT基因表达的作用机制,以及对肿瘤细胞生长、增殖、迁移、凋亡、干性等生物学功能及特性的影响。(3)建立小鼠动物模型,验证hTERT启动子结合蛋白对肿瘤生长及hTERT基因表达的影响。(4)通过免疫印迹、RT-PCR、免疫组化等实验技术手段,检测肿瘤细胞和病人组织中hTERT启动子结合蛋白的表达情况,并结合临床数据分析hTERT启动子结合蛋白在肿瘤中的特异表达、与hTERT表达的相关性及其在肿瘤分型、分期、预后、转移、复发等方面的价值。结果:(1)应用启动子垂钓系统发现了结肠癌细胞中新的hTERT启动子结合蛋白Spt6,并验证Spt6与hTERT启动子确实存在结合。(2)Spt6特异siRNA敲低Spt6表达水平,抑制了 hTERT启动子活性和端粒酶活性,并能抑制肿瘤细胞增殖和迁移,以及诱导细胞凋亡。(3)体内实验表明,Spt6敲低抑制肿瘤生长和hTERT基因表达。(4)应用免疫印迹和免疫组化等实验方法,验证了 Spt6和hTERT在肿瘤组织和细胞中的高表达和表达相关性,以及Spt6对肿瘤诊断、预后的意义。结论:本文通过生物素-链霉亲和素启动子垂钓系统,分离并鉴定出了 hTERT启动子结合蛋白Spt6,并验证了 Spt6对hTERT的表达调控机制。临床数据分析,发现Spt6与hTERT表达存在正相关,并对肿瘤诊断、预后具有重要意义,为结肠癌临床治疗提供了 一个新的潜在靶点。