【摘 要】
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三型分泌系统效应蛋白（Type 3 secretion effectors,T3SEs）通过三型分泌系统（Type 3 secretion system,T3SS）可以直接进入真核生物细胞中发挥功能。T3SEs既是致病菌侵染宿主过程中的毒性因子,也是根瘤菌与其宿主豆科植物建立共生体系过程中的影响因子。根瘤菌的T3SEs有些与致病菌的T3SEs同源,有些则为根瘤菌所特有。根瘤菌的T3SEs也被称为结
【基金项目】
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国家自然科学基金（编号:41830755和41671261）；
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三型分泌系统效应蛋白（Type 3 secretion effectors,T3SEs）通过三型分泌系统（Type 3 secretion system,T3SS）可以直接进入真核生物细胞中发挥功能。T3SEs既是致病菌侵染宿主过程中的毒性因子,也是根瘤菌与其宿主豆科植物建立共生体系过程中的影响因子。根瘤菌的T3SEs有些与致病菌的T3SEs同源,有些则为根瘤菌所特有。根瘤菌的T3SEs也被称为结瘤外蛋白（Nodulation outer proteins,Nops）。与致病菌相比,目前对根瘤菌的T3SEs研究较少,其在共生结瘤体系建立过程中的功能还有待阐明。前期研究发现,中慢生刺槐根瘤菌（Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123）与刺槐（Robinia pseudoacacia）能够建立有效的共生固氮体系,该菌株中含有两套T3SS,其中T3SS-1促进其与宿主刺槐的共生结瘤。T3SS-1的基因簇位于质粒p M0123d上。通过序列比对,在该质粒上发现了与致病菌的YopT同源蛋白NopT,以及Yop J的同源物NopJ。为了研究NopT和NopJ在M.amorphae CCNWGS0123与R.pseudoacacia共生结瘤中的功能,本研究开展以下工作:对NopT和NopJ的氨基酸序列进行生物信息学分析;分别敲除编码NopT和NopJ的基因,突变体回接原宿主刺槐,分析共生结瘤情况;利用农杆菌转化烟草体系分析NopT和NopJ是否引起植物的免疫反应,同时通过比较转录组学分析刺槐对NopT和NopJ的响应;采用酵母双杂交法筛选刺槐根c DNA文库分别寻找NopT与NopJ的靶标蛋白,并用双分子荧光互补及免疫共沉淀实验验证其相互作用;NopT和NopJ及其靶标蛋白的亚细胞定位检测。主要研究结果如下:1.M.amorphae CCNWGS0123的NopT属于YopT/Avr Pph B家族,该蛋白中含有保守的催化三联体C97/H210/D225,在编码该蛋白的nopT基因起始密码子上游存在tts box序列,且在大肠杆菌中表达时存在自切割现象;NopJ属于Yop J家族,该蛋白包含保守的催化三联体H171/E190/C232,以及豆蔻酰化位点G2和可能的自乙酰化位点K301。2.将NopT和NopJ功能缺失突变菌株（△nopT和△nop J）分别回接刺槐,接种后30天取样统计结瘤情况。结果显示,与接种野生型菌株刺槐相比,接种△nopT的刺槐株高、根长、鲜重、干重、根瘤数目以及固氮酶活性均略微下降,但差异不明显;接种△nop J的刺槐株高、根长、鲜重、干重等均有所升高,根瘤数目显著增多。表明NopT对结瘤影响不大,NopJ则阻碍结瘤。3.在烟草植株上,NopT引起超敏反应,NopJ引起快速的超敏反应。超敏反应导致烟草叶片部位叶绿素含量降低、相对电导率升高、活性氧积累,以及局部黄化、坏死。在共生结瘤前期,接种突变体菌株的刺槐根中植物激素水平（水杨酸和茉莉酸）和活性氧水平（过氧化氢）较接种野生型菌株的植株有所升高,表明NopT和NopJ能够有效抑制宿主的免疫反应;转录组分析结果显示,相比接种野生型菌株的刺槐,接种突变体菌株的刺槐中抗病基因下调,NopT和NopJ的抑制作用可能被植物抗病基因识别,激活效应蛋白引起的免疫;与接种野生型菌株的刺槐相比,接种△nopT多数基因在接种36 h后下调而在72 h上调,接种△nop J多数基因在接种36 h后下调,72 h上下调基因数基本一样,差异表达的基因多与代谢通路相关。4.在酵母和烟草细胞中,分别筛选并验证了NopT与ATP-CSACP2和HIRP的相互作用,以及NopJ与转录因子WRKY69的相互作用。在烟草细胞中,单独表达NopT、ATP-CSACP2和HIRP时均定位于细胞质膜和细胞核,共表达NopT与其靶标蛋白时不影响其亚细胞定位;单独表达时NopJ定位于细胞质膜和细胞核,WRKY69定位于细胞核,二者共表达时WRKY69仍定位于细胞核,而NopJ仅定位于细胞质膜,细胞核上未观察到。该研究为揭示三型分泌系统效应蛋白在共生体系建立过程中的具体功能奠定了重要基础,将有助于研究如何利用T3SS和T3SEs促进根瘤菌侵染豆科植物进而提高共生固氮效率。
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