乳铁蛋白-虾青素乳液递送体系的构建及其对脑神经炎症和认知障碍的干预作用

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虾青素(Astaxanthin,AST)是一种具有强抗氧化能力的脂溶性类胡萝卜素,已被证明具有神经保护作用,但由于其水溶性低,稳定性差,导致体内生物利用度较低。利用蛋白质制备AST递送体系可提高其稳定性和生物活性,研究发现乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)能够通过鼠脑微血管内皮细胞(Brain capillary endothelial cells,BCECs)的跨细胞机制实现血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)的穿过。同时,大脑中存在大量的LF特异性受体,因此利用上述特性构建LF为载体的AST递送体系,能有效发挥AST的神经保护活性。本课题首先通过加热处理诱导LF热变性形成纳米颗粒,然后采用层层静电自组装的方法,以荷正电的LF为内层,荷负电的阴离子多糖(甜菜果胶,BP或羧甲基壳聚糖,CMCS)为外层,构建双层乳液。将AST包覆于双层乳液中,并对乳液理化性质和功能特性进行了系统研究。主要内容及结论如下:(1)采用改变热处理温度的方式对LF进行改性,以LF和多糖为壁材构建AST单层和双层乳液,探究热变性和不同多糖对乳液性质的影响。圆二色光谱结果表明,热变性温度的升高促使LF二级结构中的α-螺旋构象发生分解,转变为β-折叠构象,以高温热变性的LF为原料所构建的AST单层乳液具有最小的粒径和较高的zeta电位水平,在光照稳定性方面具有最高的乳液稳定性,同时95°C处理的LF形成的乳液在贮藏过程中粒径和Zeta电位变化最小,表现出最好的贮藏稳定性。在微观形貌方面,LF稳定的单层乳液均能形成分散均匀的乳液液滴。加入阴离子多糖(BP和CMCS)后可形成LF-BP和LF-CMCS稳定的双层乳液,与羧甲基壳聚糖(CMCS)相比,甜菜果胶(BP)的加入所形成的双层乳状液具有更高的稳定性、更好的贮藏稳态和稳定AST的效果。综合实验结果,选择95°C LF-BP负载的AST乳液进行活性研究。(2)以负载AST的最佳乳液95°C LF-BP为实验药物,探究该AST乳液(AST Emulsion,AST E)在大鼠体内的代谢分布,及其在各组织中的分布情况。通过实验成功建立并验证UHPLC检测生物样品中AST的方法,同时在药代动力学实验中发现大鼠体内AST的血药浓度均随时间的变化而增加,8 h时达峰值;在组织样品检测中,结果显示灌胃后的7~9 h期间,AST E处理组的大鼠脑部的AST含量持续高于天然AST组,表明以LF为载体构建的AST E递送体系能够穿过BBB,到达脑部富集。(3)以AST E为模型药物,研究该乳液对脂多糖(LPS)诱导的C57BL6/J小鼠神经炎症反应的干预作用。通过动物行为学实验发现,膳食补充AST E可有效改善炎症引起的小鼠脑认知障碍。m RNA和蛋白免疫印迹结果也显示给炎症小鼠膳食补充AST E可有效抑制小鼠脑部炎症标志蛋白的表达,如i NOS、COX-2、IL-1β和TNF-α;并显著抑制炎症标志基因的表达,如i NOS、COX-2、IL-1β、TNF-α、IL-6。另外,膳食补充AST E后提高了炎症小鼠脑部神经营养因子相关基因的表达,并增加了与学习记忆相关的小鼠脑部突触后致密蛋白的长宽尺寸。(4)以AST E为模型药物,研究该乳液对LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症反应的影响。结果表明AST E有效恢复了细胞活力、抑制细胞中炎症标志蛋白(如i NOS、COX-2、IL-1β、TNF-α)的表达,有效下调炎症标志基因(如i NOS、COX-2、IL-1β、TNF-α、IL-6)的表达。另外,AST E的干预显著抑制了细胞NO生成量,提高细胞ATP酶活力,缓解细胞线粒体膜电势的降低,改善线粒体功能;抑制细胞内氧自由基的生成,维持细胞内氧化还原平衡。综上所述,本研究以热变性的LF为原料,以AST为负载物,通过添加多糖构建层-层静电自组装的AST E使该体系具有良好稳态的同时保护AST免受氧化。同时通过动物实验验证了AST E的良好脑部靶向效果及其对炎症小鼠神经炎症的干预作用,通过体外实验验证了AST E对小胶质细胞炎症反应的干预作用,为天然AST的加工利用提供可行策略,使之能更适合于健康食品的开发。
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