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研究目的及意义硅橡胶(silicone rubber,SR)因其生物惰性、耐腐蚀性、耐磨性、可长期体内埋存等特点,自20世纪70年代问世以来在医学领域得到了广泛的应用。现硅橡胶已成为临床最常用的软组织缺损填充的医用生物材料之一,用于修复先天性畸形、外伤或癌症切除等原因所致的胸部或面部畸形。然而,由于非极性,硅橡胶的R基位于螺旋结构的外侧,使硅橡胶表现出强烈的疏水性,材料表面生物相容性差。长期植入体内后,周围组织易形成纤维包膜。后期纤维包膜挛缩致植入材料变形、移位甚至外露。为改善这一现象,在课题组前期工作中,利用笼形倍半硅氧烷(polyhedral oligomeric silsesquioxane,POSS),将亲水性基团羧基(-COOH)引入硅橡胶,成功制备成多羧基笼型倍半硅氧烷/硅橡胶(POSS-COOH/SR)纳米杂化材料。将该改性材料长期植入大鼠体内后发现材料周围组织纤维包膜形成的厚度降低。前期工作虽然发现POSS-COOH/SR材料周围组织包膜厚度减少,但是具体机制尚不明确。相关文献报道,部分纳米复合材料表面可诱导干细胞向不同方向分化;也有研究显示在小鼠体内,观察到肌成纤维细胞向脂肪细胞转化,减轻瘢痕形成。因此,我们提出假设:POSS-COOH/SR是否影响到某些细胞的分化或转化。间充质干细胞(BMSC)是干细胞家族的一名重要成员,具有自我更新和多能分化的功能,且干细胞对材料的变化较为敏感。基于上述背景信息,本文利用大鼠间充质干细胞作为模式细胞,研究POSS-COOH/SR对大鼠骨髓间充质干细胞粘附、增殖和分化的影响,为后期进一步探究纤维包膜减少的机制研究提供理论基础。研究方法第一部分:POSS-COOH/SR纳米复合材料和SR的制备1.在室温条件下,将医用AB液态硅橡胶(各5ml)以1:1,均匀搅拌,注入金属平板磨具(10cm*10cm*0.05cm)制成膜片,硫化、固化6小时,制成SR。在电子秤上分别称取0.01-0.05g POSS-COOH各自混合在A胶5ml 30min后,加入B胶5ml,均匀混合后注入金属平板磨具内,硫化、固化6小时,制成0.1%-0.5%不同比例的POSS-COOH/SR以及普通SR实验用膜片。第二部分:POSS-COOH/SR和SR的表面形貌及理化性能检测通过使用电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)、原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM)、A型邵氏硬度计、拉曼光谱分析仪以及水接触角检测仪等分析检测普通SR及0.1%-0.5%不同比例的POSS-COOH/SR纳米复合材料的表面形貌及理化性能,相关数据采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析。第三部分:POSS-COOH/SR对骨髓间充质干细胞(rBMMSCs)粘附、增殖和分化的影响1.细胞准备:提取Sprague Dawley雌性大鼠原代骨髓间充质干细胞、分离纯化、细胞干性鉴定后进行后续实验。2.实验分组情况:1)普通SR作对照组,在SR材料表面培养大鼠的骨髓间充质干细胞(rBMMSCs)。2)0.1%-0.5%POSS-COOH/SR纳米复合材料做实验组,在各组材料的表面培养rBMMSCs,并观察各组材料对rBMMSCs黏附、增殖与分化的影响。3.使用免疫荧光、蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)等技术,观察改性后各组材料表面细胞黏附蛋白的表达情况,使用四唑盐比色实验(MTT)了解间充质干细胞在各个材料表面的增殖变化及活性情况,以对改性后的硅橡胶材料进行生物安全性能评估。4.细胞在各组材料表面培养21d后,利用油红O、茜素红S、阿利新兰染液对培养后的细胞进行三系染色。5.使用免疫荧光、WB、定量聚合酶链反应技术(qPCR)进一步从细胞、蛋白及基因层面观察各组材料对间充质干细胞分化的影响。实验结果1.成功制备了0.1%-0.5%的POSS-COOH/SR纳米复合材料。2.使用SEM观察改性材料表面微观形貌发现,普通SR与不同比例的POSSCOOH/SR表面均可见不规则的沟槽样改变,这是液态硅橡胶在硫化固化过程中,受室温变化所致,与POSS-COOH纳米颗粒的填充无关。AFM实验结果也证实,纳米复合材料及SR的纳米级表面形貌均平滑无突起后丘陵样改变。3.通过拉曼光谱分析,我们在改性的材料表面检测到了-COOH基团,且随着POSSCOOH的浓度增加而增加。但其他的官能团无明显显著增加,这也表明POSS-COOH与SR共混后并不引起SR自身官能团构成的变化。4.A型邵氏硬度测定结果表明,随着POSS-COOH在SR中的比例增加,其材料的硬度逐渐降低。5.通过水接触角结果分析得知,改性后的POSS-COOH/SR纳米复合材料的水接触角较SR明显降低,但不同比例之间无明显差异,说明POSS-COOH与SR的共混可以降低SR材料本身的疏水性。6.WB及免疫荧光结果提示,改性后的纳米复合材料表面蛋白黏附性增加,尤其是比例在0.3%-0.5%的POSS-COOH/SR复合材料上,细胞的相关粘附蛋白表达量明显高于普通SR表面的干细胞。7.三系染色后提示,SR及改性后的不同比例的纳米复合复合材料无明显成骨、成软骨分化,而改性后的纳米材料有成脂分化能力,不同比例中,成脂分化程度呈倒“U”型改变,即在浓度0.3%、0.4%时脂滴形成最明显。8.通过WB、免疫荧光以及q-PCR技术,从基因以及蛋白表达水平证实了成脂标志物PPARγ的表达。9.MTT实验检测结果显示,POSS-COOH/SR纳米复合材料表面的rBMMSCs活力较SR表面的差,证明POSS-COOH/SR纳米复合材料对rBMMSCs的增殖有一定抑制作用。结论1.POSS-COOH/SR纳米复合材料制作简单、方便,易于加工。该纳米复合材料界面理化性能稳定,既保持了SR本身的生物惰性、耐腐蚀性、易加工性以外,同时还能将-COOH的亲水性引入,从而改善硅橡胶的疏水性。2.改性后的纳米复合材料有诱导rBMMSCs向脂肪细胞分化的趋势,未见明显的成软骨分化。3.随着POSS-COOH在SR中的比例越来越大,改性后纳米复合材料的硬度越来越低,POSS-COOH的加入改变了SR的硬度,且浓度与硬度呈负相关关系。4.改性后的POSS-COOH/SR表面细胞的粘附性增强,但材料表面细胞的增殖受到一定程度的抑制。