丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是唇形科多年生药用植物,广泛分布于我国大部分地区。丹参的主要药用部位为根和根茎,作为我国重要的传统中药,在临床上有悠久的用药历史。在传统用药中,丹参多被用于治疗心脑血管疾病、各种炎症以及月经不调等。现代药理学研究证实,丹参的主要药理活性成分可分为性质不同的两大类：一类为脂溶性的丹参酮类物质,包括丹参酮IIA和隐丹参酮等；另一类为水溶性的酚酸类化合物,包括丹酚酸B和迷迭香酸等。已有研究表明,丹参酚酸类物质由酪氨酸和苯丙烷类两条代谢途径共同参与合成,中间产物迷迭香酸是合成丹酚酸B的核心前体。目前已知代谢途径上的多个关键酶基因被克隆和研究,但对于迷迭香酸合酶(SmRAS)的研究还较少。本实验以丹参迷迭香酸合酶基因(SmRAS)为研究对象,构建人工miRNA (amiRNA)表达载体,对SmRAS基因进行特异性干涉,从而对该基因的功能进行初步研究。探讨迷迭香酸合酶基因与丹参酚酸类代谢物合成之间的相关性,为阐明丹参中主要水溶性活性成分合成的分子机制提供依据,同时也为利用基因工程对丹参品质进行改良奠定基础。主要研究内容及结果如下：1.选取SmRAS基因的非保守区域为靶位点,利用WMD3(Web microRNA designer)软件设计靶向SmRAS的amiRNAs序列,然后以拟南芥MIR319a前体序列为骨架,利用重叠PCR (over-lapping PCR)技术置换MIR319a的前体序列中的miR319a/miR319a*部分,获得amiRNA前体序列；再将其插入到pCambia1302载体中的35S启动子和Nos终止子之间,构建得到特异性沉默SmRAS的amiRNA过表达植物载体。2.分别提取野生丹参根、茎、叶的RNA并反转录为cDNA,利用实时定量PCR技术研究SmRAS基因在不同组织中的表达丰度。结果表明,SmRAS基因在丹参的根、茎、叶等组织中均有表达,但在根中表达丰度最高,茎中次之,叶中含量最低。3.利用叶盘转化法浸染野生丹参叶片,经DNA和RNA水平筛选检测,得到9个生长良好的阳性转基因株系,利用半定量PCR、PCR-Southern blotting和实时荧光定量技术对阳性株系进行检测。结果表明,转基因阳性株系中SmRAS基因表达量显著低于野生对照株系,而amiRNA表达量均显著高于对照,说明本实验构建的amiRNA前体序列能够在丹参细胞内被正确的识别、加工和最终实现amiRNA的表达,从而达到了特异性沉默靶基因的效果。其次,对转基因株系中SmRAS在不同组织中的表达模式分析发现,SmRAS在转基因株系的不同组织中的表达模式与野生株系相一致,且表达量均低于野生丹参各组织中的表达量。4.对干涉及对照株系的组织培养试管苗中总酚酸含量检测发现,三个被检的干涉株系中总酚酸含量均低于对照株系。3#、6#、14#株系的总酚酸含量分别为对照的45.34%、76.22%和28.48%。5.利用HPLC技术检测转化丹参的60d龄实生苗的根中迷迭香酸和丹酚酸B的含量。结果表明,三个转基因株系较对照株系的迷迭香酸和丹酚酸B的含量均有不同程度的降低,其中14#株系中迷迭香酸和丹酚酸B的含量降低最为明显,仅为对照的49.80%和32.95%。6.对阳性转基因株系的表型进行观察,与对照丹参相比,.SmRAS基因干涉植株表现出生根时间延缓、多须根而主根较少,根表面颜色较浅,茎秆分节较多且较纤细。结论：本研究构建amiRNA表达载体介导SmRAS基因特异性沉默,获得阳性转基因株系。初步探讨丹参体内迷迭香酸合酶基因与酚酸类物质合成之间的重要相关性。为进一步利用基因工程对丹参进行品质改良奠定一定的理论基础。