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迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种革兰氏阴性短杆菌,感染宿主范围很广。由该菌引起的爱德华氏菌病是水产养殖最常见的传染病之一,给水产业造成巨大的经济损失。斑鳢(Channa maculata)属鲈形目,攀鲈亚目,鳢科,鳢属,主要分布于长江以南地区如台湾、广东等省份。斑鳢是一种肉质鲜美、营养和经济价值极高的淡水经济鱼类。随着现代集约化高密度养殖规模的扩大,斑鳢的病害较为严重,并造成极大的经济损失。为了研究迟缓爱德华氏菌对斑鳢的致病性和防治迟缓爱德华氏菌引起的疾病,本文以迟缓爱德华氏菌和斑鳢为研究对象,从病理学和免疫学角度开展了以下几个方面的研究。
1、从患病斑鳢体内分离到3株病原菌,通过对其生化特性与16S rDNA序列进行分析,确定为迟缓爱德华氏菌。3株菌对斑鳢的LD50分别为1.8×103、7.1×103、2.9×104 cfu g-1,最适生长特性为30℃、pH8、盐度1%(w/v),具有溶血活性,对环丙沙星、氧氟沙星、菌必治等抗生素敏感,五倍子、石榴皮、乌梅等中草药对其有较强的杀菌作用。
2、研究了迟缓爱德华氏菌感染斑鳢后的组织病理学变化和超微病理学变化。组织病理学变化主要有:肝细胞绝大部分坏死,形成大小不等的空泡,大量红细胞浸润;脾组织变性坏死,溶解,形成结构紊乱的坏死灶;肾小囊腔扩张,肾间质出血,大量红细胞浸润,肾小球扩张、充血,部分肾间质变性坏死;鳃小片基底部水肿,间隙变宽,其间形成空腔,部分上皮细胞坏死、脱落;心肌出血,心肌纤维间可见大量的红细胞,有的心肌纤维形成较大空隙,部分心肌纤维变性坏死;肠黏膜上皮层广泛性坏死脱落,基底膜排列紊乱,毛细血管扩张,管腔内大量的红细胞浸润。超微病理变化主要有:受感染细胞的胞质疏松,各种细胞间的间隙变大。线粒体数量减少,内质网扩张;其内的细胞器溶解消失,细胞膜破裂,胞质外溢,胞核呈溶解状态。胞质中出现许多空泡,使细胞呈现蜂窝状。部分细胞萎缩、变形。有的细胞结构已无法辨别,为紊乱的间质所取代。
3、研究了人工感染迟缓爱德华氏菌后发病斑鳢血液的生理生化参数的动态变化。斑鳢血液红细胞、白细胞数量在感染后的第12天显著升高(P<0.05);血沉、血细胞比容显著高于对照组(P<0.05);红细胞脆性变化不大,且差异不显著(P>0.05);总蛋白浓度、总胆红素浓度、直接胆红素浓度显著高于对照组(P<0.01,P<0.05);血糖浓度先升高后降低,显著低于对照组(P<0.01,P<0.05);球蛋白浓度与对照组相比没有太大的变化,到后期才有显著性的差异(P<0.05);尿酸浓度明显高于对照组(P<0.05);尿素浓度均低于对照组,且在感染后的第10天具有显著性的差异(P<0.05);肌酐浓度先降低后上升,分别在感染后的第2天和12天差异显著(P<0.05);谷草转氨酶活力显著高于对照组(P<0.05,P<0.01);感染后的初期谷丙转氨酶活力与对照组相比变化不大,但在感染后的第6天显著高于对照组(P<0.05),随后逐渐降低;钙离子浓度与对照组相比变化不大,感染第8天后显著高于对照组(P<0.05,P<0.01);感染后的初期淀粉酶活力低于对照组,感染第8天后高于对照组(P<0.05);感染后的初期超氧化物歧化酶活力高于对照组,感染至第6、8天显著低于对照组(P<0.05);酚氧化酶活力变化幅度较大,感染后第2,4天,酚氧化酶活力低于对照组,随后高于对照组,在第10天时呈现出显著性差异(P<0.05);碱性磷酸酶活力呈现先升高后降低的变化趋势,但无显著性差异(P>0.05);溶菌酶活力显著升高(P<0.05,P<0.01);酸性磷酸酶活力低于对照组,无显著的统计学差异(P>0.05);NBT阳性细胞数量均高于对照组,分别在第2,4,6天有显著的统计学差异(P<0.05)。
4、克隆了迟缓爱德华氏菌的菌毛亚基蛋白(FimA)基因,该基因开放阅读框为540bp,编码179个氨基酸,推导的蛋白分子量为18.7kDa。将FimA基因定向连接到pET-28a(+)表达载体并转化至E.coli BL21(DE3)得以表达。ELISA和Western blot分析结果表明:FimAP融合蛋白具有抗原性和免疫原性。FimAP融合蛋白与佐剂乳化后接种斑鳢,于免疫后第21天攻毒,免疫保护率为81%。
5、克隆了迟缓爱德华氏菌的磷酸盐结合蛋白(pstS)基因,该基因开放阅读框为1041bp,编码346个氨基酸,推导的蛋白分子量为36.4kDa。将pstS基因定向连接到pET-28a(+)表达载体并转化至E.coli BL21(DE3)得以表达。ELISA和Western blot分析结果表明:pstSP融合蛋白具有抗原性和免疫原性。pstSP融合蛋白与佐剂乳化后接种斑鳢,于免疫后第21天攻毒,免疫保护率为79%。