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目的本课题旨在研究胞内氯离子通道蛋白1(Chloride intracellular channel 1,CLIC1)及其截短体CLIC1(1-90aa)、CLIC1(91-241aa)与活化的蛋白激酶C受体1(Receptor for activated C kinase 1,RACK1)在真核细胞中的表达、定位及相互作用。方法以CLIC1全长c DNA序列为模板构建真核表达质粒pc DNA3.1-CLIC1(1-90)-FLAG和pc DNA3.1-CLIC1(91-241)-FLAG;将上述真核表达质粒瞬时转染至非洲绿猴成纤维细胞系COS7中,运用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)实验分析其在哺乳动物细胞中的定位情况;将前述真核表达质粒瞬时转染至人胚胎肾上皮细胞系HEK 293T中,利用Western blot技术检测其在哺乳动物细胞中的表达;利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)实验检测两者是否存在相互作用。结果经双酶切鉴定并将阳性克隆的菌液送公司测序,CLIC1的两个截短体质粒构建成功。在荧光显微镜下观察发现,pc DNA3.1-CLIC1(1-90)-FLAG的表达产物大多定位在细胞质内,而pc DNA3.1-CLIC1(91-241)-FLAG的表达产物大多定位在细胞核中;RACK1-GFP与CLIC1(1-90)-FLAG、CLIC1(91-241)-FLAG在COS7细胞中均共定位于细胞质。co-IP实验结果显示,RACK1与CLIC1(1-90)-FLAG、CLIC1(91-241)-FLAG在HEK 293T细胞中均有相互作用。结论RACK1与CLIC1的两个截短体CLIC1(1-90)、CLIC1(91-241)存在相互作用,为进一步解析二者的相互作用机制奠定了基础。目的本课题旨在研究α-辅肌动蛋白-4(alpha-actinin-4,ACTN4)在黑色素瘤恶性进展中的作用,确定ACTN4介导的黑色素瘤细胞侵袭的下游效应物以及ACTN4对BRAF抑制剂作用的影响。方法构建ACTN4 sh RNA的慢病毒质粒,运用脂质体法将病毒包装质粒转染至HEK 293T细胞中,待其在细胞中形成病毒颗粒后,收集含有慢病毒颗粒的上清感染目的黑色素瘤细胞,得到ACTN4稳定低表达细胞株。用BRAF抑制剂处理黑色素瘤细胞和ACTN4稳定敲低细胞株,收集细胞沉淀,利用Western blot实验检测黑色素瘤中ACTN4敲低产生的效应。结果成功构建ACTN4 sh RNA质粒,得到ACTN4稳定低表达黑色素瘤细胞株。敲低ACTN4会抑制黑色素瘤细胞生长。而在使用BRAF抑制剂后的ACTN4稳定低表达黑色素瘤细胞中,MAPK、AKT、NF-κB信号通路相关蛋白表达降低。结论ACTN4作为促癌因子发挥作用,可能通过调节MAPK、AKT、NF-κB信号通路促进细胞增殖,从而在黑色素瘤恶性进展中发挥作用。