沙门菌多重耐药现象日益严重,已成为全球关注的食品卫生问题。多粘菌素是一类多肽类抗生素,近年来被重新重视和使用,由于其在临床中使用量增多,导致沙门菌等革兰氏阴性菌对多粘菌素的耐药性逐渐增强,但其耐药机制尚未完全清楚,因此研究其耐药机制非常重要。本研究采用浓度递增法诱导鼠伤寒沙门菌ATCC13311（AT）,获得多粘菌素高抗性菌株（AT-P128）。首先,对两株菌的抗菌药物敏感性及其它生物学特性进行比较。然后通过比较基因组学分析两株菌基因组的差异,转录组学和q RT-PCR比较两株菌基因表达量的差异。最后,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对AT-P128的pho P基因进行敲除,比较分析pho P基因缺失前后菌株对多粘菌素的药物敏感性,探究沙门菌对多粘菌素的抗性机制。主要研究内容与结果如下:1.沙门菌体外耐药株的诱导及生物学特性研究。以AT为亲本菌株,利用浓度递增法诱导AT,获得多粘菌素高抗性菌株AT-P128。透射电镜下观察菌体超微结构,并检测两株菌的药物敏感性、生长特性、运动能力和生物膜形成能力。结果表明,与AT相比,AT-P128不仅对多粘菌素B和粘菌素表现出高水平耐药,而且对其它几种抗菌药物的敏感性也发生了变化。其中阿莫西林的MIC上升了64倍以上,氯霉素的MIC上升了16倍,头孢噻呋的MIC上升了8倍,氟苯尼考和氨苄西林的MIC上升了4倍及以上,安普霉素和四环素的MIC仅上升了2倍;而磺胺甲恶唑的敏感性下降了16倍;透射电镜观察发现AT-P128的菌毛减少,表明体外药物诱导使耐药菌的菌毛生长能力降低;诱导前后菌株的生长速度无明显差异,表明体外药物诱导对菌株的生长速度几乎没有影响;测量两株菌的菌圈直径和生物膜检测发现,AT-P128的运动能力（P<0.01）和生物膜形成能力（P<0.05）均显著下降,表明菌株通过体外药物诱导获得多粘菌素耐药性,对其运动性和生物膜形成造成了一定程度的损害。2.AT和AT-P128的全基因组测序及比较基因组学分析。对AT进行三代基因组测序获得完整的基因组序列,对AT-P128进行二代基因组测序,测序数据组装后,AT的基因组大小为4 679 519 bp,GC含量为52.05%;AT-P128的基因组大小为4 643663 bp,GC含量为52%。对两个基因组的编码基因、重复序列、非编码RNA、基因岛、前噬菌体、CRISPR进行预测,发现两个基因组的特征基本一致。AT和AT-P128均注释到50个耐药基因,这些耐药基因主要有外排泵编码基因、调控抗生素外排的基因、氨基糖苷类抗性基因、多肽类抗性基因、磷霉素抗性基因、氟喹诺酮抗性基因、氨基香豆素抗性基因、编码抗生素靶点保护蛋白和抗生素灭活酶的基因等。单核苷酸多态性分析显示AT-P128的基因组共有8个基因（ccm B、ccm H、ccm G、ccm C、pho P、ybj Z、lpt D、bas S（pmr B））发生了错义突变,其中lpt D、pho P和bas S与多粘菌素耐药性相关。3.AT和AT-P128的转录组学分析。以|Fold-change|≥2且Q-value<0.005为标准筛选差异表达基因。AT-P128/AT共筛选到1 380个差异表达基因,其中319个基因的表达量上调,1 061个基因的表达量下调。从上述结果中筛选部分耐药性与致病性相关差异表达基因,发现这些基因主要富集在双组分系统、主动外排系统、细菌趋化性、链霉素生物合成、脂多糖生物合成、外膜、鞭毛组件、菌毛、上皮细胞的细菌入侵、细菌分泌系统、沙门菌感染等通路中。选取11个差异表达基因进行荧光定量PCR（q RT-PCR）分析,结果与转录组测序一致,证实了测序结果的可靠性。转录组和q RTPCR结果均显示双组分系统Pho PQ的pho P、pho Q基因表达量升高,提示Pho PQ可能参与调控体外诱导菌的多粘菌素耐药机制。4.pho P基因缺失株的构建及药物敏感性分析。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建AT-P128的pho P基因缺失株,通过PCR鉴定和测序验证显示pho P基因缺失株构建成功。多粘菌素敏感性检测发现,与AT-P128相比,AT-P128△pho P对多粘菌素B和粘菌素的耐药性均下降了32倍,结果表明pho P基因缺失可大幅度降低AT-P128的多粘菌素耐药性。本研究在体外构建了沙门菌的多粘菌素耐药株,确定其遗传稳定性后通过生物学特性分析、全基因组测序、转录组学及基因缺失等试验方法,探究沙门菌获得多粘菌素耐药性后,其生物学特性、基因组组分、功能及基因表达水平的变化,揭示体外诱导菌产生多粘菌素耐药性的机制,为寻找抗多粘菌素耐药的新靶点,防治多粘菌素耐药菌感染提供科学依据。