研究目的:恶性肿瘤日益成为全球的首要死因,迫切需要找到治疗肿瘤的新方法。本研究将探讨肿瘤由良性到恶性转化的关键分子机制,寻找治疗这种恶性疾病的潜在靶点。试验方法:多数肿瘤都有m TOR信号通路的活化,为模拟m TOR活化的肿瘤细胞恶变的过程,使用m TOR抑制基因Tsc2-/-小鼠的胚胎成纤维细胞系,接种到裸鼠皮下筛选两次,获得在裸鼠皮下成瘤更快、恶性程度更高的Tsc2-/-MT细胞。然后,通过裸鼠成瘤试验验证获得的细胞系的恶性程度,同时对Tsc2-/-和Tsc2-/-MT细胞皮下成瘤后的肿瘤组织进行HE染色及免疫组化辅助验证;以有限稀释不同浓度的Tsc2-/-和Tsc2-/-MT肿瘤细胞接种到裸鼠皮下的方法、体外sphere试验验证细胞的干细胞特性,以细胞迁移试验辅助验证;Tsc2-/-和Tsc2-/-MT细胞的表达谱分析检测,寻找肿瘤恶变转化的关键基因;利用CRISPR-CAS9技术在细胞系里将候选的关键基因敲除;另外,为使构建的恶变转化模型及已经了解的发生发展机制应用于其他肿瘤,使用AOM和DSS联合诱导小鼠结肠癌,探索关键基因表达的变化。研究结果:与Tsc2-/-细胞相比,Tsc2-/-MT细胞在裸鼠成瘤的时间更短,生长速度更快,裸鼠的生存期更短,且较少的Tsc2-/-MT细胞也可以生成肿瘤,且Tsc2-/-MT细胞体外培养成球能力更强。提示,Tsc2-/-MT细胞的恶性程度更高,自我更新能力更强,具有较强的肿瘤干细胞特性;通过Tsc2-/-和Tsc2-/-MT细胞的表达谱分析发现,相较于Tsc2-/-,Tsc2-/-MT细胞有491个基因表达上调,744个基因表达下调,其中Clu在Tsc2-/-MT细胞中上调;于是利用CRISPR-CAS9技术在Tsc2-/-MT细胞中敲除Clu,Clu敲除细胞的裸鼠成瘤时间明显延长,肿瘤生长速度显著减缓,小鼠的生存期显著增长,并且,体外成球数显著降低,这表明Clu基因敲除后,细胞的恶性程度及干细胞特性显著降低;在AOM和DSS诱导的小鼠结肠癌模型中,通过Western Blot的检测发现,Clu在肿瘤组织中的表达是上调的,这表明Clu表达的变化与小鼠结肠癌的发生发展有相关性。结论:1、肿瘤干细胞在m TOR活化的细胞恶变转化中起重要作用;2、Clu在m TOR活化的肿瘤恶性转化中通过调控细胞的肿瘤干细胞特性调控细胞的恶性转化;3、Clu是肿瘤治疗新靶点