间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）具有自我更新,多向分化以及免疫调节等特性,在修复组织损伤、治疗癌症等疾病方面具有广泛的应用前景。超低温冻存是长期保存MSCs的有效方法。在冻存保护剂（cryoprotectant,CPA）的保护下,冷冻至超低温环境（<-150℃）的细胞会停止新陈代谢,达到“休眠”状态,进而长期维持生物活性。当前,二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）是冻存MSCs常用的CPA,但其具有细胞毒性,会影响MSCs的正常功能。此外,移植DMSO冻存的MSCs会诱发病人产生过敏、心率失常、器官衰竭等副反应。因此,开发生物相容性好、冻存效率高的CPA,代替DMSO冻存MSCs具有重要意义。本研究使用两性离子分子甜菜碱结合可逆电穿孔技术实现了无DMSO化的MSCs高效保存。具体研究内容如下:本文首先测试了甜菜碱抑制冰晶形成的能力。结果表明,甜菜碱可以增加溶液中非冻结水含量,降低溶液的冰点,有望减少细胞受到的冰晶损伤。渗透压平衡实验表明,甜菜碱可以保护细胞免受氯化钠模拟的高渗环境造成的渗透压损伤,这可能是由于甜菜碱可以通过细胞膜上的转运载体进入细胞,进而平衡细胞内外渗透压。抗氧化实验证明了甜菜碱能够抑制活性氧的产生,并清除部分氧化自由基,具备抗氧化特性。细胞毒性实验表明,在不同浓度（2%～10%）、不同孵育温度（4或37℃）和不同孵育时间（0.5、1、12或24 h）条件下,甜菜碱均表现出了良好的生物相容性。相比之下,DMSO会显著降低细胞的存活率,具有明显的细胞毒性。基于以上甜菜碱良好的冻存保护特性和生物相容性,本文对甜菜碱的冷冻保存效果进行了测试,结果表明,单独使用甜菜碱作为CPA,无法有效冻存MSCs。在冻存前,将MSCs与甜菜碱共孵育4 h,复苏后细胞的存活率可提高至50%。进一步结合可逆电穿孔技术,复苏后细胞的存活率可提高至85%,且多项体外功能均未发生改变。这是由于电穿孔后细胞膜上会形成暂时性的亲水性孔,非特异性地提高MSCs的通透性,促进甜菜碱进入细胞,提升甜菜碱对细胞的保护效果。MSCs的体内归巢分布与细胞治疗的效果紧密相关。本文利用慢病毒转染和流式细胞分选技术构建了稳定表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和萤火虫荧光素酶（firefly luciferase,Fluc）的UCMSCs（GFP-Fluc-UCMSCs）。结果表明,甜菜碱结合可逆电穿孔技术可高效冻存GFP-Fluc-UCMSCs。生物发光成像结果表明该保存技术不会影响GFP-Fluc-MSCs的体内归巢分布特性,有望推进无DMSO化冻存细胞的临床应用。