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甘草是中国大宗药材之一,其药材基源为豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、光果甘草(G.glabra L.)和胀果甘草(G.inflata Batal.)的根和根茎。甘草属植物物种较多,全球约有20个物种,中国就有8种,但并非所有的甘草属植物都适合作为药用;且由于早年甘草自然资源丰富且分布较广,各地甘草生境差异大,生态条件复杂,各地间的种质资源在数千年流转中又交流频繁,导致甘草属植物的遗传差异较大,药用物种变种较多;此外,建国后,由于甘草用途日益广泛,野生甘草资源被大量挖掘,使得市场在供不应求的状态下向栽培甘草发展,而栽培甘草的价值相较野生甘草较低并且更容易出现变种,致使甘草市场药用质量不高;同时,各地民间用药习惯差别较大,甘草的临床药用得不到统一,安全性和有效性得到了很大的质疑。以上原因导致甘草市场现状混乱。尽管在以往的甘草研究中,科研工作者对甘草进行了系统的分类研究,但所得出的结论并不一致,且随着物种的不断进化和演变,新物种是否出现尚待考察。为保证甘草药材产业化生产的良好发展、确保甘草药材质量以及临床用药的安全性和有效性,本研究以采集自中国不同地区以及中亚部分国家的211份甘草为材料,采用DNA条形码、目标起始密码子多态性(SCoT)分子标记技术和简单重复区间多态性(ISSR)荧光分子标记技术,针对甘草属植物间的遗传特性和亲缘关系进行了比较分析,主要结果如下:
1.以125个国内不同地区采集的6种表观鉴定到种的甘草样本为研究对象,利用PCR扩增获得其ITS2序列和psbA-trnH序列,通过对其ITS2和psbA-trnH序列的变异位点和单倍型的分析,建立了一套以ITS2序列为主,psbA-trnH序列为辅的甘草属DNA条形码鉴定方案。该方案的遗传距离分析和单倍型统计分析结果显示:ITS2和psbA-trnH序列相结合能够将6种甘草属植物中的G.uralensis、G.pallidiflora、G.yunnanens括、G.aspera这4个物种相互区分开,也可以将其与G.glabra和G.inflata区分开,但无法对G.glabra和G.inflata进行有效区分。聚类分析表明,非药用甘草物种G.aspera和3种药用甘草(G.uralensis、G.glabra和G.inflata)之间的亲缘关系较近,但与其它2种非药用甘草物种(G.pallidiflora、和G.yunnanensis)的亲缘关系较远。为中国药用甘草和非药用甘草的有效区分提供了技术支持。
2.利用SCoT分子标记技术对125个国内不同地区采集的6种表观鉴定到种的甘草样本进行个体间的聚类分析,结果显示:125个甘草样本中,部分G.uralensis可聚为一支;大部分的G.glabra和G.inflata聚集在一个大组群中,且相互掺杂,不能单独聚为一支;G.pallidiflora可单独聚为一支;G.yunnanensis按不同采集地聚为两支——采集自云南的G.yunnanensis和采集自四川的G.yunnanensis分别聚为一支,可能是由于生态环境不同导致的遗传分化;G.aspera不能很好的聚为一支,无法判断。由此可见,SCoT分子标记技术在本实验中仅对G.pallidiflora和G.yunnanensis有较好的聚类,而对其它物种甘草样本的聚类并不突出,不同样本个体之间所表现出的遗传多样性较大,不能很好的表示其亲缘关系,认为SCoT分子标记技术对于大批量植株单个样本间的聚类分析可能并不特别适用。
3.利用ISSR荧光分子标记技术对125个国内不同地区采集的6种表观鉴定到种的甘草样本进行个体间的聚类分析,其结果与DNA条形码结果相似:125个甘草样本中,大部分G.uralensis可聚为一支;大部分的G.glabra和G.inflata聚集在一个大组群中,且相互掺杂,不能单独聚为一支;G.pallidiflora可单独聚为一支;G.yunnanensis可单独聚为一支;G.aspera能聚为一支,且与G.uralensis在一个大组群中。在亲缘关系方面,G.uralensis和G.aspera的亲缘关系较近,再与G.inflata和G.glabra聚为一大支,而非药用甘草物种G.pallidiflora和G.yunnanensis的亲缘关系较近,与其它4个物种相比,单独成为一支,亲缘关系较远。由此可见,ISSR荧光分子标记技术能较好的将各个不同的物种进行聚类,并能较好的表现出其亲缘关系的远近,相较于SCoT分子标记而言,可以更有效的研究本实验所收集的甘草属植物单个样本间种质资源的亲缘关系。
4.利用通过ITS2和psbA-trnH序列确定的甘草属DNA条形码方案、SCoT分子标记技术和ISSR荧光分子标记技术对来自中国43个表观判定为变异植株的甘草样本,以及41个采集自中亚5个国家的未鉴定到种的甘草样本进行亲缘关系的鉴定研究。
结果表明:本实验中采集自国外的甘草属植物均与3种药用甘草亲缘关系相近,故可对其药用活性成分进行分析,判断其是否符合中国甘草药用标准,也可为后期优良品种的选育提供潜在的亲本;而国内变异植株经DNA条形码技术和ISSR分子标记技术鉴定,除4个疑似G.pallidiflora的样本与G.pallidiflora聚为一支,亲缘关系较近,其余样本均与三种药用甘草亲缘关系较近,与G.pallidiflora和G.yunnanensis亲缘关系较远。而SCoT分子标记技术仅能对4个疑似G.pallidiflora的样本进行较好的聚类,且不能很好的突出其亲缘关系。
1.以125个国内不同地区采集的6种表观鉴定到种的甘草样本为研究对象,利用PCR扩增获得其ITS2序列和psbA-trnH序列,通过对其ITS2和psbA-trnH序列的变异位点和单倍型的分析,建立了一套以ITS2序列为主,psbA-trnH序列为辅的甘草属DNA条形码鉴定方案。该方案的遗传距离分析和单倍型统计分析结果显示:ITS2和psbA-trnH序列相结合能够将6种甘草属植物中的G.uralensis、G.pallidiflora、G.yunnanens括、G.aspera这4个物种相互区分开,也可以将其与G.glabra和G.inflata区分开,但无法对G.glabra和G.inflata进行有效区分。聚类分析表明,非药用甘草物种G.aspera和3种药用甘草(G.uralensis、G.glabra和G.inflata)之间的亲缘关系较近,但与其它2种非药用甘草物种(G.pallidiflora、和G.yunnanensis)的亲缘关系较远。为中国药用甘草和非药用甘草的有效区分提供了技术支持。
2.利用SCoT分子标记技术对125个国内不同地区采集的6种表观鉴定到种的甘草样本进行个体间的聚类分析,结果显示:125个甘草样本中,部分G.uralensis可聚为一支;大部分的G.glabra和G.inflata聚集在一个大组群中,且相互掺杂,不能单独聚为一支;G.pallidiflora可单独聚为一支;G.yunnanensis按不同采集地聚为两支——采集自云南的G.yunnanensis和采集自四川的G.yunnanensis分别聚为一支,可能是由于生态环境不同导致的遗传分化;G.aspera不能很好的聚为一支,无法判断。由此可见,SCoT分子标记技术在本实验中仅对G.pallidiflora和G.yunnanensis有较好的聚类,而对其它物种甘草样本的聚类并不突出,不同样本个体之间所表现出的遗传多样性较大,不能很好的表示其亲缘关系,认为SCoT分子标记技术对于大批量植株单个样本间的聚类分析可能并不特别适用。
3.利用ISSR荧光分子标记技术对125个国内不同地区采集的6种表观鉴定到种的甘草样本进行个体间的聚类分析,其结果与DNA条形码结果相似:125个甘草样本中,大部分G.uralensis可聚为一支;大部分的G.glabra和G.inflata聚集在一个大组群中,且相互掺杂,不能单独聚为一支;G.pallidiflora可单独聚为一支;G.yunnanensis可单独聚为一支;G.aspera能聚为一支,且与G.uralensis在一个大组群中。在亲缘关系方面,G.uralensis和G.aspera的亲缘关系较近,再与G.inflata和G.glabra聚为一大支,而非药用甘草物种G.pallidiflora和G.yunnanensis的亲缘关系较近,与其它4个物种相比,单独成为一支,亲缘关系较远。由此可见,ISSR荧光分子标记技术能较好的将各个不同的物种进行聚类,并能较好的表现出其亲缘关系的远近,相较于SCoT分子标记而言,可以更有效的研究本实验所收集的甘草属植物单个样本间种质资源的亲缘关系。
4.利用通过ITS2和psbA-trnH序列确定的甘草属DNA条形码方案、SCoT分子标记技术和ISSR荧光分子标记技术对来自中国43个表观判定为变异植株的甘草样本,以及41个采集自中亚5个国家的未鉴定到种的甘草样本进行亲缘关系的鉴定研究。
结果表明:本实验中采集自国外的甘草属植物均与3种药用甘草亲缘关系相近,故可对其药用活性成分进行分析,判断其是否符合中国甘草药用标准,也可为后期优良品种的选育提供潜在的亲本;而国内变异植株经DNA条形码技术和ISSR分子标记技术鉴定,除4个疑似G.pallidiflora的样本与G.pallidiflora聚为一支,亲缘关系较近,其余样本均与三种药用甘草亲缘关系较近,与G.pallidiflora和G.yunnanensis亲缘关系较远。而SCoT分子标记技术仅能对4个疑似G.pallidiflora的样本进行较好的聚类,且不能很好的突出其亲缘关系。