研究背景：蚊是一类重要的媒介昆虫,它不仅叮咬人类,而且能够传染多种疾病,如登革热、疟疾、丝虫病、黄热病,流行性乙型脑炎等,对人类的健康产生很大危害。蚊子的吸血,交配,产卵等主要依赖于其嗅觉系统。蚊的嗅觉系统主要包括嗅觉结合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)、嗅觉受体(odorant receptors, ORs)以及嗅觉受体神经元(olfactory receptor neurons,ORNs),其主要分布在触角、上颌须以及喙,其内部含有多种形态各异的嗅觉感应器(简称嗅器)。在整个嗅觉发生过程中,嗅觉结合蛋白和嗅觉受体起着关键作用。因此,蚊嗅觉受体功能的研究,对蚊媒传染病的防控具有重要意义。目前研究表明冈比亚按蚊含有79个嗅觉受体基因,埃及伊蚊含有131个嗅觉受体基因,淡色库蚊含有180个嗅觉受体基因。对白纹伊蚊嗅觉受体基因(Ae. Albopictus olfactory receptor)的研究较晚,国内对于白纹伊蚊嗅觉受体基因的研究至今仍是一片空白。直到2012年5月,世界上才有第一个白纹伊蚊嗅觉受体基因的研究报道,即白纹伊蚊嗅觉受体基因2(AalOr2),其编码区有6个外显子被5个内含子分离,cDNA全长1556bp,最终的蛋白产物含376个氨基酸,且有7个跨膜区。蚊Orco基因是蚊嗅觉受体基因家族的一部分,它能够和嗅觉受体基因共同作用,识别气味分子。果蝇,冈比亚按蚊,淡色库蚊,埃及伊蚊的Orco基因分别是其嗅觉受体基因Or83b,AgOr7,CqOr7,AaeOr7<当外界气味分子进入蚊嗅觉系统时,气味分子首先和嗅觉结合蛋白(OBP)结合,OBP将气味分子运送至嗅觉受体(OR),由于嗅觉受体基因表达在嗅觉受体神经元(ORN)细胞膜上,所以气味分子的刺激可以改变ORN细胞膜离子通道的开放或者关闭,进而影响细胞膜内外电压的变化。嗅觉受体神经元细胞膜电位的改变信号传送到蚊中枢神经系统,进而引起蚊行为的变化,对气味分子是趋避或者被引诱。至于Orco基因是否可以增强嗅觉受体基因对气味的识别能力,有待于进一步研究证明,现有研究表明Orco基因和Or基因共同作用对于气味的识别能力具有选择性。在对部分气味分子的识别过程中,Orco基因确实可以增强Or基因对于气味的识别能力,但是对于另一部分气味的识别能力,Orco基因对Or的增强作用不是很理想。避蚊胺(DEET)是常用的蚊媒趋避剂,已广泛使用近六十年,它可以扰乱蚊子对于人汗液气味分子的识别功能,起到趋避的效果。吲哚类气味分子是一种重要的蚊媒引诱剂,吲哚在人体汗液气味分子占近30%。在用近30种气味分子刺激白纹伊蚊嗅觉受体基因Or2和黑腹果蝇Orco基因共表达的人类胚胎肾细胞(HEK293)时,其胞内钙离子的浓度在吲哚刺激下达到最高,这证实了白纹伊蚊嗅觉系统对吲哚的反应很强烈,当然,在幼虫行为实验中,也证实了吲哚对于白纹伊蚊幼虫的吸引作用。基于此,本研究用避蚊胺(DEET)和1-甲基3-吲哚两种气味分子刺激白纹伊蚊嗅觉受体基因Or7单独表达和其与冈比亚按蚊Orco基因共表达的HEK293细胞,研究表明：在气味分子1-甲基-3-吲哚刺激下,胞内钙离子的浓度逐步上升至峰值；相反,在避蚊胺(DEET)刺激下,其胞内钙离子浓度不断下降至基线值以下。蚊嗅觉基因对于气味分子浓度变化的识别是蚊媒嗅觉系统研究的一个热点。在用五种相同浓度10-3气味分子刺激埃及伊蚊嗅觉受体基因AaeOr2和AaeOr7共表达的爪蟾卵母细胞时,发现,细胞对于避蚊胺(DEET)的反应最为强烈。同样的结果也出现在埃及伊蚊嗅觉受体基因AaeOr8和AaeOr7共表达的爪蟾卵母细胞中。有趣的是,当用气味分子吲哚浓度为10-7M刺激两组共表达的爪蟾卵母细胞时,细胞对该浓度下吲哚的反应极其强烈,远高于细胞在避蚊胺(DEET)为10-3M浓度刺激下的反应强度。尽管如此,当DEET浓度在10-10M增加到10-5M的过程中,细胞对DEET的反应也逐步增强,并在10-SM浓度时候达到峰值,同样的变化趋势也发生在吲哚的刺激下。更加有趣的是,AaeOr10和AaeOr7共表达的爪蟾卵母细胞中也出现相同的变化趋势。这进一步证实了和埃及伊蚊嗅觉受体基因AaeOr7共表达的AaeOr2,AaeOr8,AaeOr10,具有相同的DEET气味应答谱。研究目的：本研究选择了一个白纹伊蚊嗅觉受体基因Or7为研究对象,通过实验技术等方法分析其可能含有的气味识别功能及分子机制,为蚊媒传染病的预防和控制提供理论基础。研究方法：1.白纹伊蚊嗅觉受体基因Or7的识别及编码区全长序列的获得。以本实验室白纹伊蚊基因组测序数据为基础,通过tBLASTn的方法,以埃及伊蚊Ors的氨基酸序列作为索引,对白纹伊蚊基因组DNA序列进行同源比对分析,找出白纹伊蚊嗅觉受体基因Or7的部分序列。通过RT-PCR扩增获得AalOr7编码区序列全长,导入p-EASY质粒后测序鉴定,从而获得AalOr7的编码区cDNA序列全长。利用生物信息学技术对经测序鉴定的AalOr7的ORF序列所推导编码的氨基酸序列进行分析。2.利用RT-PCR技术,分析AalOr7在白纹伊蚊不同发育时期及不同组织中的表达情况。3.以AalOr7的ORF序列和pME18S真核表达载体的多克隆位点设计引物,以经过测序鉴定的p-EASY-AalOr7质粒为模板,PCR扩增AalOr7的编码区全长序列,将其连接到pME18S载体上,获得重组质粒pME18S-AalOr7。4.将真核表达载体pME18S-AalOr7转染人类胚胎肾细胞HEK293细胞,通过RT-PCR鉴定其表达情况。5.选择1-甲基-3-吲哚,DEET等常用引诱趋避剂,刺激已表达真核表达载体pME18S-AalOr7的HEK293细胞,进而初步研究AalOr7对于气味的识别功能。研究结果：1.测序获得AalOr7基因的编码区全长序列是1395bp,其推导的氨基酸序列长度为464aa.通过生物信息学技术分析发现其推导的氨基酸序列含有跨膜区,可能属于跨膜蛋白。氨基酸序列比对发现,白纹伊蚊Or7与埃及伊蚊Or7之间的同源性为98%。2.RT-PCR检测白蚊伊蚊嗅觉受体基因Or7在幼虫,蛹,成蚊等不同发育时期都有表达,且在雌蚊的嗅器(喙,触角,上颌须)中表达明显,但在雄蚊中的表达量偏低。3.连接得到真核表达载体pME18S-AalOr7。4.通过RT-PCR鉴定白纹伊蚊Or7在HEK293细胞中表达明显。5.在1-甲基-3-吲哚、DEET刺激下,利用钙成像技术,初步检测HEK293细胞胞内钙离子浓度的变化,发现,AalOr7对钙离子具有一定的调控功能,进而影响细胞对于气味的识别能力。研究结论：1.成功构建白纹伊蚊嗅觉受体基因AalOr7的真核表达载体pME18S-AalOr7。2.AalOr7在白纹伊蚊不同发育阶段都有表达,且在雌蚊嗅器中表达明显。3.利用钙成像技术初步分析白纹伊蚊嗅觉受体基因AalOr7具有对气味的识别功能。