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野鸟作为禽流感病毒的天然宿主和原始病毒库,伴随着其迁徙的季节性,跨地域性及长距离性等特点,在禽流感病毒全球范围内的广泛传播中扮演着重要的角色。我国东北地区生态环境丰富多样,森林、湿地、湖泊、平原及沼泽草甸等自然生境为多种鸟类的栖息繁衍提供了良好的天然条件,是东北亚野鸟迁徙的重要通道。为了掌握该地区禽流感病毒野生宿主分布特点,掌握其遗传变异规律,为防制禽流感提供科学依据,我们在2012年3月至2013年5月对该地区野鸟禽流感病原进行了调查,并分析了分离株的分子特征、遗传进化及其对不同宿主的致病性。1.野鸟源禽流感病毒的分离与鉴定2012年3至2013年5月对东北地区三个省份及河北秦皇岛主动开展了野生鸟类禽流感病原分子流行病学调查,共采集样野鸟个体1279份,包括6个目,30个属,57个种。通过鸡胚传代分离纯化病毒、血凝抑制及RT-PCR确定禽流感病毒亚型,结果有14个野鸟AIV检测为阳性,阳性率为1.09%。阳性样本中有7株H3N8亚型,3株H5N1亚型,2株H3N2亚型,1株H6N2,1株H6N6,其中首次从野生雀形目黄眉柳莺中分离到了一株高致病性H5N1禽流感病毒,首次从野生鸳鸯中分离到H3N2亚型禽流感病毒。2.三株野鸟源H5N1亚型HPAIVs的遗传进化及其致病性分析2.1三株病毒HA蛋白裂解位点均含有连续的4-6个碱性氨基酸,具有HPIV的特征。NA分子颈部都存在49-68位氨基酸的缺失。MD/JL/36 在 PB1, PB1-F2蛋白368、66位点分别检测到I-V, N-S突变,提示其可能具有在哺乳动物之间传播的能力。三株病毒M1分子30、215位点均发生了N-D, T-A的突变。M1蛋白与流感病毒抗金刚烷胺药物相关的位点27 (V-A),31 (S-N)突变在MD/JL/36和YBW/HLJ/18中分别被检测到。另外,YBW/HLJ/18在NSl蛋白92位检测到了D-E的突变。2.2三株病毒都属于2.3.2血统分支,此分支的毒株主要分离于2009-2011年的野鸟和水禽,分布于中国内地、中国香港、蒙古、韩国和日本等东亚国家。2.3三株病毒对鸡都表现出高致病性,死亡率为100%。三株病毒对鸭的致病性差异性较为明显。YBW/HLJ/18在5-6天内死亡率为100%,MD/JL/36在试验期内死亡率为20%,而CS/HLJ/137在试验期内没有出现任何临床症状,死亡率为0%。三株病毒可以通过喉和泄殖腔排放,导致同居鸭感染,均能在鸭各个脏器中有效的复制。2.4 YBW/HLJ/18和CS/HLJ/137在小鼠五种组织器官中都能有效复制,其中在肺中病毒滴度最高。感染CS/HLJ/137的小鼠在第11天全部死亡,致死率达100%,YBW/HLJ/18致死率为80%,而MD/JL/36仅为20%。CS/HLJ/137, YBW/HLJ/18和MD/JL/36三株病毒对小鼠的半数致死量分别为3.5,>6.5和>6.5。3.野鸟源H3N8亚型LPAIVs的遗传进化及其致病性分析3.1同源性比较结果表明：三株病毒的8个基因片段都表现出较高的多样性,都属于新的重组病毒。3.2三株H3N8 AIV HA蛋白裂解位点均为PEKQTR*GLF,仅含有一个碱性氨基酸,具有LPIV的特征。三株H3N8病毒蛋白片段中对病毒宿主特异性选择,致病性及耐药性相关的氨基酸位点均末发生突变。3.3分离的7株H3N8禽流感病毒HA基因均属于亚洲分支,且与马流感的遗传距离较远。3.4三株H3N8禽流感病毒经鼻腔感染SPF鸡后,在整个试验期内没有表现出任何临床症状。MD/LN/51和RCC/HLJ/98不能在鸡组织脏器中复制,在泄殖腔和喉头中也没有发生排毒反应。MD/JL/22可以在鸡法氏囊,盲肠扁桃体,胸腺中有效复制并通过泄殖腔向环境中排毒,导致同居鸡的感染。3.5三株H3N8禽流感病毒经鼻腔感染SPF鸭后,在整个试验期内同样没有表现出任何临床症状。但感染后3-7d大部分感染和同居鸭都可以通过喉头和泄殖腔向外排毒,并感染同居鸭。在感染后的14和21d,血清抗体都呈阳性。三株病毒均可以在鸭肾、脾、法氏囊及盲肠扁桃体内复制。3.6 MD/JL/22和RCC/HLJ/98两株病毒均可以在小鼠肺脏和鼻甲骨中有效复制,而MD/LN/51在所有脏器组织中均没有检测到病毒复制。MD/JL/22和RCC/HLJ/98均可导致小鼠肺脏出现局部性的淤血和间质性肺炎的病理变化。4.鸳鸯源H3N2亚型LPAIV的遗传进化及其致病性分析4.1同源性比较结果表明：该株H3N2亚型AIV 8个基因片段表现出较高的多样性,属于新的重组病毒。4.2 HA蛋白裂解位点序列为PEKQTR*GLF,具有LPIV的特征。病毒蛋白片段中与其对宿主特异性选择,致病性及耐药性相关的氨基酸位点均末发生突变。4.3分离株HA基因属于Avian分支,此分支与Canine分支表现为较近的遗传关系,它们共同聚到一个大分支,与Equine分支遗传距离最远。4.4 MD/HLJ/1分离株经鼻腔感染SPF鸡和鸭后,在整个试验期内没有表现出任何临床症状。分离株不能在鸡组织脏器中复制,但是可以刺激机体产生特异性免疫反应,在感染后14和21d,部分鸡血清中检测出特异性抗体。MD/HLJ/1可以在鸭肺、法氏囊、胰腺及盲肠扁桃体内复制,大部分攻毒和同居鸭都可以通过口腔和泄殖腔向外排毒。另外,MD/HLJ/1可以刺激鸭体产生特异性的免疫反应,所有攻毒和同居鸭在14和21d都有血清转阳情况。4.5 MD/HLJ/1可以在小鼠肺脏和鼻甲骨中有效复制,可导致小鼠肺脏出现局部肺泡间隔增宽,中度间质性肺炎病理变化。整个试验期内小鼠体重仅表现为一过性的降低。