安络小皮伞高产菌株选育、发酵工艺优化及相关药效研究

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安络小皮伞(Marasmius androsaceus)为我国传统的药用真菌,安络小皮伞在我国民间主要用来治疗跌打损伤,骨折疼痛,坐骨神经痛,偏头痛,麻风性神经痛和风湿关节痛等。在工业规模化生产中,原料主要是采用固体培养法得到的安络小皮伞菌丝体发酵物。研究表明其主要化学成分有甘露醇、胆甾醇醋酸酯、氨基酸、对羟基肉桂酸、麦角甾醇、以及大量的糖类和蛋白质类成分等。本研究采用两种诱变技术对安络小皮伞原始菌株进行改良:硫酸二乙酯诱变育种和亚硝酸钠诱变育种。经多层次筛选,得到一株遗传稳定的优良菌株,命名为T08。其菌丝体干重较原始菌种提高了36.40%。同时遗传稳定性结果显示,该菌种T08的高产性能是可以稳定遗传的。此外,本章研究对获得的安络小皮伞突变菌种T08有效成分进行了初步确认,证实其发酵菌丝体产物含有的化学成分有氨基酸、多糖、多肽、酚类、内酯、油脂、萜类、生物碱和皂苷等。综合考虑高产菌株T08发酵菌丝体干重、胞内多糖、甘露醇和腺苷产量,将满意度函数应用到安络小皮伞的发酵培养基和发酵罐培养条件探索过程中。分别顺次通过单因素实验、Box-Behnken设计实验、多元二次回归分析以及人工神经网络结合遗传算法等模型优化安络小皮伞高产菌株T08的发酵培养基组分及发酵罐培养条件。结果显示:安络小皮伞高产菌株的最佳培养基配方(g/L):蔗糖23.1,蛋白胨10,酵母浸粉10.4,七水硫酸镁1,三水磷酸二氢钾0.86,维生素B10.1;最佳5L发酵罐培养条件为:初始pH6.14,转速289r/min,发酵时间6.28day,发酵温度26℃,接种量5%,种龄4day,通气量200L/h,装液量3.5L/5L,相较于初始培养条件,该菌的菌丝体干重、腺苷、多糖和甘露醇的产量也分别提高了35.02%、23.34%、187.05%和74.45%。高产安络小皮伞T08镇痛活性研究:通过醋酸诱导扭体实验、福尔马林诱导实验和热板实验对安络小皮伞镇痛组分进行初步筛选;通过自主活动实验和平衡转棒实验考察该菌丝体产物的乙醇提取物是否存在一定的神经毒性;通过若干拮抗剂筛选、单胺组分水平测定以及蛋白印迹实验确定该乙醇提取物发挥镇痛作用可能存在的机制,最终确定安络小皮伞菌丝体乙醇提取物发挥镇痛作用是通过抑制多巴胺的合成而发挥作用的,其效果与多巴胺合成抑制剂相类似。高产安络小皮伞T08抗抑郁活性研究:通过小鼠自主活动实验、平衡转棒实验和初期安全性实验以确定安络小皮伞代谢多糖是否存在一定的毒性;通过行为绝望模型中强迫游泳实验和悬尾不动实验初步确定代谢多糖的抗抑郁能力;通过5-HTP和RES诱导模型、单胺类水平变化和蛋白印迹实验确定该代谢多糖发挥抗抑郁类似效果可能存在的机制;通过大鼠慢性不可预知应激模型,考察体重变化、蔗糖水偏嗜度、强迫游泳实验、悬尾不动实验和单胺类水平变化等动物模型实验以进一步探讨代谢多糖可能存在的抗抑郁类似效果。结果显示,安络小皮伞T08发酵代谢多糖能够发挥一定的抗抑郁类似效果,该效果与其能够调控儿茶酚胺系统神经递质等相关,符合抑郁症发病的单胺假说。
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