青光眼(glaucoma)是眼科最常见疾病之一,被世界卫生组织列为第二大致盲性眼病,是不可逆性致盲的最主要原因。青光眼以视神经乳头病变、神经节细胞数目减少和视野缺失为特征,眼内压增高和血流动力学改变是其最重要的致病因素,视网膜神经节细胞损伤是其基本病理基础。在青光眼众多的病理过程中,胞外过量聚集的谷氨酸所产生的兴奋毒性作用得到大多数实验室的认可,但青光眼视网膜神经节细胞损伤的确切机制还不十分清楚。Muller胶质细胞是脊椎动物视网膜主要的一类胶质细胞,在解剖和功能上与视网膜各层神经元的胞体和突起有广泛联系。除了传统认为的对神经元支持、营养作用,Muller细胞和神经元之问的信息交换和相互作用在维持视网膜神经元功能中发挥有重要作用。近年来,胶质细胞的激活(reactivation)在神经系统损伤和疾病病理过程中的作用日益受到人们的重视,几乎所有的神经系统(包括视网膜)损伤和疾病都伴随有胶质细胞的激活。胶质细胞激活,即细胞由成熟状态转化为非成熟的分化状态,其作用包括两个方面,一方面,是细胞对损伤所做出的急性反应,通过释放神经营养因子和抗氧化物质,以及摄取胞外集聚的谷氨酸等,从而阻止神经元的进一步损伤,促进神经轴突的再生和突触重塑；另一方面,激活的细胞也可释放多种细胞毒性因子(如NO.TNF.ROS.PGE2等),这些细胞因子作用于神经细胞,诱发其凋亡或死亡。同时,激活的胶质细胞可形成胶质瘢痕,阻止轴突的再生和神经生长。因此,研究胶质细胞的激活机制,对理解神经细胞损伤的机制和神经再生、修复具有重要的意义。在视网膜损伤和疾病(包括青光眼)病理过程中,Muller胶质细胞的功能变化已有了众多的研究,其共有的特征之一是都有Muller细胞的激活,即标志性的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达上调。同时,Muller细胞膜离子通道(例如K+、Ca2+等)功能发生改变,其中,细胞膜钾电导的下调(尤其是Kir4.1介导的膜电流)至关重要。然而,有关Kir电流下调的机制和Muller细胞激活机制的研究报道不多。针对这一科学问题,我们先前在慢性高眼压实验性青光眼大鼠模型上的研究发现,高眼压所致胞外增高的谷氨酸过度激活Muller细胞的I型代谢型谷氨酸受体(mGluR I),进而压抑Kir通道导致Muller细胞的激活。尽管如此,仍然有许多问题悬而未决。如导致Kir蛋白下调和/或下膜的分子机制是什么?激活mGluR l是否影响Kir通道蛋白的合成?除了Kir4.1,在Muller细胞表达的Kir2.1发生了什么变化,是否也参与Muller细胞的激活?要回答这些问题,离体纯化培养的视网膜Muller细胞是个理想的标本。为此,本课题利用原代细胞培养、免疫荧光细胞化学、Western blot、real-time PCR等多种技术手段,在纯化培养的大鼠视网膜Muller细胞上,利用mGluR I特异性激动剂DHPG处理来模拟慢性高眼压大鼠视网膜Muller细胞的病理状态,研究了激活mGluRI对Muller细胞GFAP蛋白表达量的影响,进而研究了其对Kir4.1通道蛋白的调控。主要结果如下：(1)采用原代细胞培养方法,用5天龄的Sprague Dawley大鼠经过传代成功纯化出视网膜Muller细胞。第三代细胞用免疫荧光染色Muller细胞特异性蛋白谷氨酰胺合成酶(GS),激光共聚焦显微镜扫描,显示纯化程度达90%以上；(2)用10 μM的DHPG处理纯化培养的MuIler细胞不同时间(0.5、1、3、5、7、9、12和24 h),利用Western blot检测GFAP蛋白总量的表达变化,发现DHPG处理后GFAP表达在5-9 h显著增加,其后逐渐恢复到对照水平,提示Muller细胞的激活,从而建立了离体纯化培养的大鼠视网膜Muller细胞激活模型；(3)利用Western blot检测DHPG处理后不同时间Muller细胞Kir4.1蛋白总量的表达变化,未发现明显变化；(4)然后利用膜蛋白提取试剂盒,分离得到细胞膜蛋白,Western blot检测DHPG处理后不同时间Kir4.1蛋白的表达变化,发现Kir4.1蛋白在Muller细胞膜组分的表达量随DHPG处理时间逐渐降低,在7h和9 h统计学结果有显著性差异,提示激活mGluR I诱导Kir4.1通道蛋白下膜,从而导致Miuller细胞功能性的Kir通道下调；(5)利用免疫荧光细胞化学检测DHPG处理不同时间Muller细胞膜上Kir4.1蛋白的表达变化,发现细胞膜蛋白caveolin-1和Kir4.1的共标随时间逐渐减少,进一步确认了mGluR 1诱导的Kir4.1蛋白的下膜；(6)利用real-time PCR技术,我们检测了DHPG处理不同时间MuIler细胞Kir4.1和Kir2.1 mRNAs的表达变化,结果发现DHPG处理0.5 h时Kir4.1 mRNA显著降低,而Kir2.1 mRNA在0.5 h和9 h时显著低于对照组,表明激活mGluR I可能导致Muller细胞Kir4.1及Kir2.1蛋白的合成减少。综上所述,我们在离体纯化培养的大鼠视网膜Muller细胞,利用DHPG激活mGluR I建立了Muller细胞激活的细胞模型。激活mGluR l诱导培养的大鼠视网膜Muller细胞Kir4.1通道蛋白下膜,同时Kir转录水平的下调可能导致Kir蛋白的合成减少,从而导致Muller细胞膜上功能性Kir通道的减少,共同参与Muller细胞的激活。这些阶段性的研究成果为进一步深入研究Kir通道下调和Muller细胞激活的分子机制,探讨抑制胶质细胞激活,进而保护神经元损伤的途径奠定了基础。