【摘 要】
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利用CRISPR/Cas系统结合等温核酸扩增建立的核酸检测技术,可以实现对ASFV的快速现场化检测,对防控非洲猪瘟具有重要意义。本研究建立了一种高灵敏度和特异性的CRISPR/Lb Cas12a结合环介导等温扩增（LAMP-CRISPR/Lb Cas12a）的技术,采用了ROX修饰的ss DNA-FQ报告基因和RNA-DNA嵌合型cr RNA,可实现即时快速现场化检测（POCT）ASFV CD2v
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（No. 32072685）；
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利用CRISPR/Cas系统结合等温核酸扩增建立的核酸检测技术,可以实现对ASFV的快速现场化检测,对防控非洲猪瘟具有重要意义。本研究建立了一种高灵敏度和特异性的CRISPR/Lb Cas12a结合环介导等温扩增（LAMP-CRISPR/Lb Cas12a）的技术,采用了ROX修饰的ss DNA-FQ报告基因和RNA-DNA嵌合型cr RNA,可实现即时快速现场化检测（POCT）ASFV CD2v基因。主要结果如下:（1）构建了p ET28a-Lb Cas12a重组质粒,确定了高效诱导Lb Cas12a蛋白表达的最佳条件,通过原核蛋白表达和镍离子亲和层析法,制备了纯度高、活性强的Lb Cas12a蛋白;（2）设计并筛选到靶向ASFV CD2v基因的高活性且序列保守的cr RNA,建立了利用LAMP-CRISPR/Lb Cas12a技术裸眼可视化检测ASFV CD2v基因的方法。评估发现该技术检测限达到8.88 copies/μL,并且不会交叉检测到其他病毒基因,这些结果表明本研究开发的LAMP-CRISPR/Lb Cas12a技术可以实现高灵敏和高特异检测ASFV CD2v基因;（3）为了方便现场快速检测ASFV,通过提升ROX修饰的ss DNA-FQ报告基因的浓度和采用RNA-DNA嵌合型cr RNA,实现了在白光条件直接裸眼可视化检测ASFV CD2v基因。评估发现采用LAMP-CRISPR/Lb Cas12a技术可检测到猪血清中的CD2v基因,表明本研究开发的技术具有良好的现场快速检测病毒核酸的能力;综上所述,本研究成功建立了一种采用LAMP-CRISPR/Cas12a技术实现高灵敏和高特异性检测ASFV CD2v基因的新方法,尤其是该技术可在白光下直接观察检测结果,能检测猪血清中的CD2v基因。该技术能够帮助生猪养殖企业实现栏边现场快速早期检测非洲猪瘟病毒,帮助其精准扑杀受病毒感染的猪,由此增强企业的疾病防控能力,因而具有一定的推广应用价值。
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