【摘 要】
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我国是世界第一养猪大国,生猪存栏量与猪肉产量均处于世界第一位。当前我国养猪业面临诸多瓶颈问题,而疫病问题是制约我国养猪业健康发展的主要问题。猪圆环病毒2型是猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus associ ated di sease,PC VAD）的主要病原体,PCVAD的流行给我国养猪业造成了严重的经济损失。抗原表位作为抗原抗体相互作用的识别、结合位点,是抗原最为重要的性质
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我国是世界第一养猪大国,生猪存栏量与猪肉产量均处于世界第一位。当前我国养猪业面临诸多瓶颈问题,而疫病问题是制约我国养猪业健康发展的主要问题。猪圆环病毒2型是猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus associ ated di sease,PC VAD）的主要病原体,PCVAD的流行给我国养猪业造成了严重的经济损失。抗原表位作为抗原抗体相互作用的识别、结合位点,是抗原最为重要的性质之一,通过鉴定病毒的抗原表位可以了解病原微生物的致病机制和抗体发挥保护作用的机制,同时,抗原表位的鉴定也为研发新型表位疫苗奠定了基础。Cap蛋白作为PCV2的免疫蛋白,虽然已有的研究确定了其表面的部分免疫区段,但仍有许多线性表位和结构表位未鉴定出。对于PCV2抗原的表位鉴定,目前大多采用单克隆抗体进行,但由于传统单克隆抗体分子体积过大,只能结合位于完整抗原分子表面的表位,而不能识别一些隐蔽表位,纳米抗体的出现很好的克服了传统单克隆抗体的这些缺点,其相对分子质量小的优势使其能够识别传统抗体无法识别的位于抗原分子内部的隐蔽表位。本研究通过对实验室前期建立的PCV2 Cap蛋白纳米抗体噬菌体库进行四轮的生物淘选,最终获得了 6个抗PCV2 Cap蛋白纳米抗体基因序列。将筛选到的纳米抗体基因序列克隆至pCold-SUMO表达载体中,获得了 6个重组原核表达载体,分别命名为 PCV2-Cap-Nb-50、PCV2-Cap-Nb-55、PCV2-Cap-Nb-56、PCV2-Cap-Nb-57、PCV2-Cap-Nb-85和PCV2-Cap-Nb-86,随后将重组载体分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,并通过镍柱对重组蛋白进行纯化。SDS-PAGE电泳和Western blot实验结果表明6个纳米抗体在大肠杆菌中以可溶的形式成功表达。通过ELISA实验对纳抗的效价进行测定后发现,6个纳米抗体均特异性地与PCV2 Cap蛋白结合,其中PCV2-Cap-Nb-56的ELISA效价最高,可以达到1:104,PCV2-Cap-Nb-50、PCV2-Cap-Nb-55、PCV2-Cap-Nb-57、PCV2-Cap-Nb-86 的 ELISA 为 1:103,PCV2-Cap-Nb-85的ELISA效价最低,仅为1:102。病毒中和实验结果显示纳抗PCV2-Cap-Nb-55和PCV2-Cap-Nb-56可以中和PCV2病毒,其中和效价均为24,而其他纳抗均无中和效价。为进一步确认PCV2-Cap-Nb-55和PCV2-Cap-Nb-56是否结合不同的抗原位点,我们将PCV2 Cap蛋白作为包被抗原,采用竞争ELISA对两个纳抗的结合位点进行鉴定,结果表明PCV2-Cap-Nb-55和PCV2-Cap-Nb-56竞争结合Cap蛋白的同一个抗原表位。由于PCV2-Cap-Nb-55的实验结果较为理想和稳定,综合考虑之下,本研究选择用它进行后续实验。为进一步分析中和纳米抗体阻断PCV2感染的机制,将PCV2和PCV2-Cap-Nb-55孵育后感染PK-15细胞,通过IFA实验观察感染情况,结果显示PCV2-Cap-Nb-55通过与PCV2结合,阻止病毒吸附在细胞膜表面,从而达到阻断PCV2感染PK-15细胞的作用。本研究同时利用Cap蛋白的截短片段,鉴定出PCV2-Cap-Nb-55与Cap蛋白结合的抗原表位。首先将利用分子生物学软件对Cap蛋白的表位进行预测,根据预测结果,将Cap蛋白分成9个截短片段,分别是（Cap-A,Cap1-122）、（Cap-A1,Cap1-78）、（Cap-A2,Cap79-122）、（Cap-B,Cap123-203）、（Cap-B1,Cap123-163）、（Cap-B2,Cap163-203）、（Cap-B3,Cap123-159）、（Cap-B4,Cap148-184）和（Cap-B5,Cap185-203）,利用 Primer5.0软件设计特异性引物,PCR扩增后将截短片段克隆至pET-32a表达载体,转化BL21（DE3）表达菌株后进行诱导表达及纯化。利用Western blot和ELISA方法,分析PCV2-Cap-Nb-55与截短蛋白的特异性结合反应,初步确定了 PCV2-Cap-Nb-55识别的抗原表位于PCV2 Cap蛋白的aa148-aa159区域。本研究通过对实验室前期构建的PCV2 Cap蛋白纳米抗体噬菌体库进行生物淘洗,筛选到6个PCV2 Cap蛋白特异性纳米抗体序列,并在大肠杆菌中成功表达。中和试验证明6个纳米抗体中,有2个纳米抗体具有中和活性且结合相同的抗原位点。通过鉴定PCV2-Cap-Nb-55所识别的抗原表位,确定了 PCV2Cap蛋白新的抗原表位,这为PCV2免疫机制研究与PCV2表位疫苗研发奠定了基础。
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