目的:习惯性流产是指连续发生3次或3次以上的流产。其中60％左右为不明原因习惯性流产(URSA)，主要与免疫因素有关。生殖免疫研究认为，URSA是由于孕期母体对胚胎父系抗原耐受性不足或缺乏所致。因此，调节母体针对胚胎父系抗原的免疫应答，有效诱导母胎免疫耐受，是治疗URSA的关键。　　目前，国内外多采用患者丈夫或无关个体的T淋巴细胞对URSA母体进行免疫治疗，取得了明显疗效，但仍存在制备不规范、个体差异大、疗效不稳定等缺陷，限制了临床推广应用。近年来研究发现，T细胞在生长增殖过程中分泌释放的一种称为Exosomes(Exo)的膜性非细胞微囊结构，可携带T细胞的核心功能分子，其独具优势的强稳定性、可规范性及高效安全性极具研究价值和广阔应用前景。本研究采用URSA实验动物模型，分析成年男性T淋巴细胞来源Exo调节母胎界面穿孔素以及CD28分子的表达，探讨其诱导母胎免疫耐受的相关免疫学机制。　　方法:　　1.成年男性T淋巴细胞来源Exo的制备及初步鉴定:取成年健康男性静脉血提取淋巴细胞，经植物凝集素(PHA)体外诱导转化增殖后采用蔗糖密度梯度离心联合超滤技术获得Exo;扫描、透射电镜观察形态结构，紫外分光光度法测定其蛋白含量。　　2.雄性小鼠无关个体脾细胞及其Exo的制备:断颈处死BALB/c雄鼠，无菌条件下解剖获取脾脏，经研磨、过滤，去除红细胞后制备脾细胞悬液，经刀豆蛋白A(ConA)体外诱导转化增殖后采用蔗糖密度梯度离心联合超滤技术获得Exo。　　3.URSA动物模型建立及实验分组:将雌雄小鼠按2∶1合笼交配;CBA/J(♀)×BALB/c(♂)为正常妊娠对照组(Control)，CBA/J(♀)×DBA/2(♂)为URSA动物模型。再将URSA孕鼠随机分为4组:①妊娠丢失组(URSA组，于孕第4天着床期时尾静脉注射生理盐水)②细胞治疗组(Cellular Therapy组，于孕第4天时尾静脉注射无关雄性个体脾细胞）③鼠源Exo治疗组(Exo Therapy-Ⅰ组，于孕第4天尾静脉注射小鼠雄性个体脾T淋巴细胞来源Exo)④人源Exo治疗组(Exo Therapy-Ⅱ组，于孕第4天时尾静脉注射成年男性T淋巴细胞来源Exo)。　　4.胚胎发育情况的观察:于妊娠第14天时分别将各组CBA/J孕鼠处死，测量并计算胎盘体积，计数各组吸收胚胎个数和存活胚胎个数，计算胚胎吸收率及妊娠丢失率。　　5.孕鼠母胎界面穿孔素及CD28分子的表达分析:各组CBA/J孕鼠于妊娠第14天分别处死，解剖孕鼠取出胎盘组织，制备石蜡包埋切片。经免疫组化染色后进行图像分析，穿孔素及CD28分子表达强度以灰度值(GS)表示，GS值大小与阳性表达强度呈负相关关系;以矩形走形计数200个淋巴细胞，分别计算各组阳性细胞表达百分率。　　6.统计学处理:各组数据均通过SPSS13.0版本软件行正态性检验、方差齐性检验，采用卡方检验比较各组孕鼠胚胎发育情况;采用F检验对孕鼠胎盘穿孔素及CD28分子的表达进行单因素方差分析(ANOVA)，S-N-K法对多个样本均数间进行两两比较。显著性检验水准α=0.05。　　结果:　　1 Exo的初步鉴定　　扫描及透射电镜下观察发现，T细胞来源Exo呈椭圆形或圆形杯口状，直径约30nm～100nm，双层脂质膜完整，内为低电子密度物质。紫外分光光度法检测鼠源Exo、人源Exo蛋白含量分别为0.413±0.067,0.407±0.082(P＞0.05)。　　2不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠胚胎发育的影响Control组孕鼠胚胎吸收率为5.65％，URSA组为21.15％，细胞治疗组、鼠源Exo治疗组、人源Exo治疗组分别为8.01％、3.41％、2.05％。与URSA组相比，细胞治疗组、非细胞治疗组的胚胎吸收率均显著下降(均P＜0.01)，其中，细胞治疗组及鼠源Exo治疗组可降至Control组水平（均P＞0.05），而人源Exo治疗组降低至低于Control组水平(P＞0.05）。　　Control组孕鼠妊娠丢失率为26％，URSA组为66％，细胞治疗组、鼠源Exo治疗组、人源Exo治疗组分别为24％、18％、14％。与URSA组相比，细胞治疗组、非细胞治疗组的妊娠丢失率均显著下降（均P＜0.01）;其中，细胞治疗组及鼠源Exo治疗组可降至Control组水平（均P＞0.05），而人源Exo治疗组降低至低于Control组水平(P＜0.05）。　　3不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠母胎界面穿孔素表达的影响　　Control组孕鼠胎盘组织中穿孔素阳性细胞表达率为18.7％±2.0％，URSA组显著上升为29.9％±2.6％(P＜0.0005);细胞治疗以及鼠源、人源Exo治疗后阳性细胞表达率分别回降至17.7％±1.2％、13.0％±1.9％、11.1％±2.1％(均P＜0.0005);其中，两种非细胞治疗组较细胞治疗组及Control组表达水平均显著降低(均P＞0.05)，鼠源、人源Exo治疗组之间未见显著差异(P＞0.05)。　　Control组孕鼠胎盘组织中穿孔素表达强度的GS值为130.9±6.1，URSA组显著上升为93.9±9.9(P＜0.0005);细胞治疗以及鼠源、人源Exo治疗后表达强度分别回降至134.0±5.9、154.2±8.2、154.7±9.3(均P＜0.0005);其中，非细胞治疗组较细胞治疗组及Control组表达水平均显著降低(均P＞0.05)，鼠源、人源Exo治疗组之间未见显著差异(P＞0.05）。　　4不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠母胎界面CD28分子表达的影响　　Control组孕鼠胎盘组织中CD28分子阳性细胞表达率52.7％±5.3％，URSA组显著上升为65.8％±8.2％（P＜0.05）;细胞治疗以及鼠源、人源Exo治疗后阳性细胞表达率分别回降至50.2％±4.7％、34.7％±5.6％、25.8％±4.4％(分别P＜0.05、P＜0.001、P＜0.001);其中非细胞治疗组较细胞治疗组及Control组表达水平均显著降低(均P＜0.05)，人源Exo治疗组比鼠源Exo治疗效果更显著(P＜0.05)。　　Control组孕鼠胎盘组织中CD28分子表达强度为117.9±2.7，URSA组显著上升为96.7±6.8(P＜0.001);细胞治疗以及鼠源、人源Exo治疗后表达强度分别回降至117.3±2.2、130.9±4.7、143.9±7.1(分别P＜0.05、P＜0.001、P＜0.001);其中非细胞治疗组较细胞治疗组及Control组表达水平均显著降低(均P＞0.05)，人源Exo治疗组比鼠源Exo治疗效果更显著(P＜0.0005)。　　结论:　　1无关雄性个体外周淋巴细胞和T细胞来源Exosomes均可有效诱导母胎免疫耐受形成，有利于妊娠顺利进行。且Exosomes可发挥比外周淋巴细胞更强大的效应。　　2无关雄性个体外周淋巴细胞和T细胞来源Exosomes均可通过共同或相似的作用途径引发母胎界面穿孔素及CD28分子表达变化，降低T、NK细胞对胚胎抗原及胎盘组织细胞的毒性作用，从而有效诱导母胎免疫耐受。　　3人源Exosomes可比鼠源Exosomes发挥更强大的诱导妊娠丢失孕鼠母胎免疫耐受的效应。