论文部分内容阅读
目的:(1)构建重组慢病毒载体OVA-Luc-GFP-p LVA7,包装出慢病毒后感染H22细胞,建立能稳定表达OVA、GFP及Luc蛋白的H22细胞株。(2)用此细胞系构建小鼠原位肝癌模型,利用小动物成像仪检测Luc(荧光素酶)及GFP(绿色荧光蛋白)表达,探索此模型的应用。方法:(1)构建重组慢病毒载体OVA-Luc-GFP-p LVA7,设计引物应用PCR技术得到OVA-Luc融合基因,经Eco RI-HF和Hind III-HF双酶切并纯化PCR产物,同时提取慢病毒载体p LVA7(带有GFP标签),经Eco RI-HF和Hind III-HF双酶切;通过DNA assembly mix连接酶,将OVA-Luc融合基因装载到慢病毒载体p LVA7中并测序验证。提取慢病毒辅助质粒p MD2.G、包膜蛋白质粒ps PAX2,三质粒系统用PEI(聚乙烯亚胺)转染293T细胞制备病毒,感染H22细胞。显微注射仪挑选稳定表达OVA-Luc-GFP-H22单克隆,扩增成细胞系。(2)将此细胞系注射到小鼠肝脏构建原位肝癌动物模型,通过小动物成像仪检测GFP基因表达及Luc荧光素酶基因的表达。结果:(1)构建的OVA-Luc-GFP-p LVA7重组慢病毒载体经酶切电泳和测序结果与预期基因序列一致。经293T细胞包装慢病毒上清,感染H22细胞系通过荧光显微镜能检测GFP表达,利用生物发光成像可检测Luc表达;成功用显微注射仪分选出稳定表达OVA-Luc-GFP-H22单克隆,并扩增细胞系。(2)以OVA-Luc-GFP-H22细胞系成功建立小鼠原位肝癌模型,利用小动物成像仪可检测Luc荧光素酶的表达,但未检测到GFP绿色荧光蛋白表达。结论:(1)构建重组慢病毒载体OVA-Luc-GFP-p LVA7,包装出表达OVA-Luc-GFP基因病毒,并感染H22细胞,建立稳定表达OVA-Luc-GFP-H22细胞系,并在体外表达。(2)成功利用OVA-Luc-GFP-H22细胞系建立小鼠原位肝癌模型,实现小鼠肝癌细胞的体外活体监测。