研究背景与目的由于颌骨与牙周组织的解剖生理特点、增龄性变化以及手术、外伤、炎症和拔牙等导致的牙周支持组织缺损、三维骨量不足或骨量丧失等是目前临床常见的问题。如何重建牙周支持组织、减少失牙、促进种植修复的长期成功率和美观效果一直是牙周与种植治疗领域中的难题。引导组织再生(GTR)或引导骨再生(GBR)技术是解决这一临床难题最常用、最有效的方法之一。GTR/GBR的原理是在牙龈软组织与牙周(骨)缺损之间放置生物屏障膜,以阻止软组织长入、保持和支撑缺损空间,最终实现完全牙周(骨)组织修复。使用屏障膜是GTR/GBR技术中的关键环节,屏障膜的性能在一定程度上决定了GTR/GBR技术的成败。可吸收性屏障膜由于使用方便、避免了不可吸收性膜需要二次手术的不足而得到广泛应用。理想的可吸收性膜应具备良好的生物相容性、能选择性的引导组织再生、一定的机械强度、易操作性、降解速率与组织再生进程协调等特性。而目前的可吸收性膜仍存在吸收速率不易控制、机械强度低、临床可操作性差及缺乏骨诱导活性等缺点,难以达到牙周组织再生的要求；也由于制备工艺复杂、成本高等原因而限制了其临床应用。研制新型的可吸收生物膜,使其不仅具有阻隔软组织细胞的屏障作用而且具有一定的促进组织再生活性,是目前医用可吸收生物屏障膜的发展趋势。高分子多聚物壳聚糖以其良好的成膜性和生物活性而成为一种极具潜力的膜材,但也存在只溶于酸性介质、脆性大、不易降解等缺点,通过与其它材料复合及在碱性溶液中浸泡等方法可以克服这些缺点,但合成工艺繁琐。本研究利用壳聚糖／p-甘油磷酸钠(CS/β-GP)温敏凝胶体系具有在生理条件下发生相转变的特性,加之其良好的生物相容性、制备工艺简单、不添加化学溶剂和交联剂、具有缓释性能等优点,制备CS/β-GP复合引导骨再生屏障膜并对其进行结构表征、力学强度测试和体内外的生物学性能研究,以期为制备一种工艺简单、成膜条件温和、具有良好生物学性能和有效缓释生长因子的新型生物屏障膜提供研究基础。方法1. CS/β-GP温敏凝胶及其复合膜的制备与表征：本实验使用的CS分子量(Mw)约为为3.5×106Da、脱乙酰度(DD)95%,并用0.1M乙酸溶液配制成浓度为2.2%(w/v)的CS溶液,并经121℃高压灭菌10分钟。分别将0.4,0.6,0.8,1.0和1.2g的β-GP溶解于1mL去离子水,在冰浴中逐滴加入到CS溶液中,获得不同配比的的CS/β-GP混合溶液。测定p-GP浓度对凝胶体系pH值和在生理体温下形成凝胶时间的影响,并初步观察凝胶的形貌特征。将不同配比的CS/β-GP混合溶液分别在平皿中铺膜,并在37℃条件下自然脱水干燥,制备成CS与p-GP质量比分别为1：3(M1膜),1：4(M2膜),1：5(M3膜)与1：6(M4膜)的CS/β-GP复合屏障膜。纯CS膜(M0)在相同条件下制备后,用0.5N的NaOH溶液中和2小时,去离子水反复冲洗后作为对照。分别通过傅里叶红外光谱(FTIR)分析、x射线衍射(XRD)分析和扫描电镜(SEM)观察对CS/β-GP复合膜的结构和形貌特征进行表征,并通过万能电子拉力仪测试膜在液态环境中的拉伸强度。2.体外实验部分：本实验部分对比研究和观察了不同配比的CS/β-GP复合膜与纯CS膜在PBS溶液中的降解特性、溶胀度以及在1.5SBF中的矿化特性；进而选择两种p-GP含量不同的复合膜(M1,M3),通过与体外小鼠骨髓基质细胞系ST2细胞的共培养,观察CS/β-GP复合膜对骨髓基质细胞体外活性的影响,包括增殖活性、细胞在膜表面的粘附与生长以及ALP活性表达等。3.体内实验部分：本实验部分通过Wistar大鼠(3月龄)皮下植入实验和颅骨临界骨缺损修复实验,对比研究和观察了CS/β-GP复合膜与纯CS膜在体内的生物相容性、降解特点、屏障作用及引导骨再生的性能。4.复合膜性能改进的初步探索：利用羧甲基壳聚糖(CMCS)络合钙离子的特性合成新型含钙化合物—羧甲基壳聚糖钙(CCC),通过FTIR、XRD对其进行结构表征,并检测其与BMSCs的细胞相容性。在CS/β-GP温敏凝胶体系中加入不同质量的CCC,观察其对凝胶时间的影响；在CS/β-GP温敏凝胶体系的合成过程中加入生长因子—釉基质蛋白(BMPs),观察BMPs对凝胶时间的影响,并制备成含生长因子的CS/β-GP/BMPs复合生物膜,通过体外实验初步观察CS/β-GP/BMPs复合生物膜对BMSCs的ALP活性的影响。本实验部分通过在CS/β-GP温敏凝胶体系中添加CCC和BMPs,初步探讨影响温敏凝胶相转变的机制和缓释生长因子的作用,为今后新型复合膜的制备和性能改进提供前期预实验基础。结果1.在CS/β-GP温敏凝胶体系中,当10mL浓度为2%的CS溶液中加入的β-GP量达到0.6g时,CS/β-GP溶液在37℃条件下出现溶胶-凝胶相转变。所形成的CS/β-GP温敏凝胶呈乳白色半透明,内部结构质地均匀,呈多孔相连的网架状,孔径约为3～-50μm左右。随着β-GP含量增加,其溶液的pH值升高,体系凝胶时间缩短,当β-GP含量达到1.2g时,5分钟即可凝胶。在37℃条件下CS/β-GP凝胶脱水干燥成膜,相同体积的溶液成膜后的厚度与p-GP的含量成正比。CS/β-GP复合材料的IR图谱分析：CS的氨基与p-GP的羟基结合形成共价键,CS的氨基同时与磷酸根之间形成离子键结合。磷酸根特征峰仍然存在,说明仍存在较多未结合的p-GP单体。CS/β-GP复合材料的XRD图谱分析显示：当CS溶液中加入β-GP后,由于-OH和P043-根的作用,降低了CS的结晶度,所以CS的结晶峰降低,峰形变得平缓。SEM观察：CS/β-GP复合膜具有粗糙的表面结构和多孔的内部结构,且p-GP的含量越高形成的孔隙直径越大,膜的表面越粗糙。拉伸强度实验发现：在液体环境中CS/β-GP复合膜的拉伸强度比单纯的CS膜明显降低,且随着β-GP含量增加,CS/β-GP复合膜的拉伸强度亦降低,复合膜的拉伸强度范围约为0.78mpa～1.13MPa。2.体外实验：与纯CS膜相比,CS/β-GP复合膜体外降解在早期较明显,特别在第1天其失重率可达60-70%左右,3天后降解速度变得缓慢,14天后复合膜的失重率可达80%左右：CS/β-GP复合膜具有明显的吸水作用,其在去离子水中的溶胀度与与p-GP含量有关,p-GP含量越高,其溶胀度越高,考虑到复合膜在液体环境中质量的快速下降,其溶胀度与p-GP含量的关系有待进一步实验探讨；CS/β-GP复合膜在1.5SBF溶液中可快速发生表面矿化,β-GP含量高的复合膜其矿化程度越高。与BMSCs体外共培养,发现CS/β-GP复合膜能够促进BMSCs的体外增殖活性,其粗糙的表面有利于细胞在膜表面的粘附和生长,并能明显促进BMSCs的ALP活性表达。3.体内实验：植入皮下2周后,CS/β-GP复合膜周围形成纤维结缔组织包裹,并开始出现降解,周围可见炎性细胞浸润和巨噬细胞；而纯CS膜未出现明显降解,炎症反应不明显。植入皮下4周后,CS/β-GP复合膜明显降解,呈连续的网状结构,且p-GP含量越高其降解越明显,膜周围炎症反应和巨噬细胞基本消失；而CS膜在皮下植入4周后其表面开始出现轻度降解,并出现轻度炎症反应。修复大鼠CSD实验4周后,复合膜覆盖的骨缺损区内可见少量的新生骨及纤维结缔组织填充,而纯CS膜覆盖的缺损区内未见新骨形成。4.复合膜性能改进的初步探索：在室温、pH7.0的条件下,氯化钙饱和水溶液缓慢滴入0.5%(w/v)的CMCS溶液,搅拌,反应10min,得到白色固体粉末。FTIR与XRD表征分析表明CMCS的COO与Ca2+络合,部分Ca2+与-NH2及-OH配位络合,形成CMCS与钙化合物CCC；由于钙离子的作用破坏了CMCS的结晶度,所以CCC的结晶峰变得低平。在CS/β-GP溶液中加入CCC后,由于CMCS与Ca2+之间的结合状态不稳定,遇到β-GP(含Na+)后发生了离子替换。CS、β-GP、CMCS与Ca2+之间发生一定的键合作用,Ca2+起到了物理交联剂的作用,导致凝胶体系的凝胶时间缩短。当过多的CCC (400mg)加入10mL的CS/β-GP体系后,溶液发生快速凝固,失去温敏特性。在温敏凝胶合成过程中将1000,2000μg的EMPs分别加入10mLCS/β-GP溶液中,凝胶时间未出现明显变化；制备的CS/β-GP/EMPs复合膜可以明显促进体外培养BMSCs的ALP活性表达。结论浓度为2%(w/v)、分子量为3.5×106Da、脱乙酰度为95%的壳聚糖溶液中加入6～12%(w/v)的β-甘油磷酸钠配合形成了壳聚糖温敏凝胶体系。在常温、pH值中性条件下CS/β-GP溶液保持液态,而在37℃温度条件下转变为稳定的半固体凝胶,再经空气干燥后成膜。利用CS/β-GP温敏凝胶体系在生理条件下发生液-固相转化的特性制备引导骨再生屏障膜,其制备方法简便、条件温和,经FTIR、XRD、SEM表征和力学性能测试表明,CS/β-GP复合膜具有粗糙的表面结构、多孔的内部结构和一定的机械强度,适于GBR的应用要求。体外、体内实验表明：CS/β-GP复合膜具有良好的体外降解、溶胀和促进表面矿化的特性；具有促进BMSCs增殖、粘附、生长和分化特性；具有体内生物相容性好、降解速率可调控以及促进骨缺损修复的特性。在CS/β-GP温敏凝胶体系中加入一定量的含钙化合物CCC,可以明显缩短凝胶的时间；在CS/β-GP温敏凝胶体系中加入一定量的生物活性小分子蛋白EMPs不影响体系的凝胶时间,所形成的CS/β-GP/EMPs复合膜可以有效促进体外BMSCs的ALP活性表达。CS/β-GP复合膜的性能改进及其引导成骨活性有待进一步实验研究。