论文部分内容阅读
Homeobox（HB）家族是一类重要的转录因子,该家族中多个亚类的成员均与木质化的过程密切相关。因此,系统研究竹子HB家族基因成员在竹子木质化过程中的功能,为实现人为调控木质素组分和含量具有重要参考价值。本研究以毛竹（Phyllostachys edulis）为研究对象,从HB家族的全基因组鉴定出发,对其基因结构、编码氨基酸的基本理化性质、保守结构域和GO功能等进行分析与预测,在此基础上结合不同发育阶段的转录组数据,以及qRT-PCR结果对其表达模式进行了分析,并对PeKNOX9和PeKNOX18的功能进行了初步研究。主要结果如下:1.毛竹HB家族的全基因组鉴定应用生物信息学方法对毛竹HB家族进行全基因组鉴定与分析。结果在毛竹全基因组中鉴定获得了115个毛竹HB基因（PeHB1～PeHB115）。根据PeHBs编码蛋白的保守结构域的特点,结合毛竹、水稻和拟南芥的系统进化分析,PeHBs被分为BEL、DDT、HD-ZIP I～IV、KNOX、NDX、PHD、PINTOX、PLINC、SAWADEE和WOX 13个亚类。GO功能预测分析表明,有19个PeHBs与毛竹木质化过程相关。共表达网络分析显示,这19个PeHBs中有10个具有共表达相关性,蛋白互作预测结果推测KNOX亚类的3个PeHBs是核心蛋白。2.PeHBs基因表达模式分析qRT-PCR分析结果表明,随着毛竹竹笋高度增加其木质化程度的加深,除PeHB005外,其余18个PeHBs的表达均呈上调趋势,但表现出持续上升或先上升后下降等不同的变化趋势。此外,采后储藏过程中冬笋木质素含量随储藏时间的延长而增加,木质化程度加深,其中14个PeHBs的表达量变化与不同高度笋中类似;另外,在Pe4CL、Pe C3H、Pe CCR和Pe COMT 4个与木质素合成相关的结构基因的启动子中发现含有KNOX的结合基序,并且其表达量随木质化程度的增加而明显增加,而且与5个PeKNOXs的表达趋势相同。这为PeHBs参与木质素生物合成过程的调控提供了有力的证据。3.在酵母中验证PeKNOXs的调控作用在酵母中进行转录自激活活性分析发现,PeKNOX1具有转录自激活活性,而PeKNOX2、PeKNOX8、PeKNOX9和PeKNOX18均没有转录自激活活性。基于酵母双杂实验,初步判断PeKNOX9与Pe BELL5、PeKNOX18与Pe BELL18、PeKNOX2与Pe BELL21可能存在较弱的互作关系,PeKNOX9与Pe BELL9、PeKNOX8与Pe BELL21存在较强的互作关系;PeKNOX9与Pe OFP1存在强互作关系,但需要近一步实验分析验证。由酵母单杂交实验结果初步推断PeKNOX9构建的效应载体表达的蛋白能够识别特定基序TGACAGC-motif。由此推测,PeKNOXs既能与其他蛋白相互作用,也能与特定顺式作用元件相结合,从而参与调控毛竹笋木质化的过程,为核心蛋白。4.PeKNOX9功能初步分析克隆得到了PeKNOX9,该基因编码区全长903 bp,上游启动子区域存在大量的能够响应高温和干旱的顺式作用元件。该基因能够编码一个300aa的蛋白,预测该蛋白具有KNOX 1、KNOX 2和Homeobox-KN保守结构域,但没有ELK结构域。组织特异性表达分析表明,PeKNOX9在毛竹的根、茎和叶等组织中均有表达,而且在叶片和茎中的表达量相对较高。此外,在干旱、盐、4℃低温和42℃高温胁迫条件下,能够诱导PeKNOX9的表达,表明该基因可能对胁迫响应具有重要的作用。过量表达PeKNOX9的拟南芥莲座叶的数量和叶面积均增加,这表明PeKNOX9能影响转基因植株的生长。5.PeKNOX18功能初步分析克隆得到了PeKNOX18,其基因组序列为1 863 bp,包含2个外显子和1个内含子,编码区全长为1 038 bp,能够编码一个345 aa的蛋白,预测该蛋白具有KNOX家族的4个特征结构域。启动子序列分析表明,PeKNOX18的启动子区域具有多个与激素相关的调控元件。组织特异性表达分析表明,PeKNOX18主要在毛竹的茎秆中表达,其中幼嫩的茎秆中的表达量最高,而在叶中表达量极低。此外,外源ABA能够诱导PeKNOX18表达,而GA3则抑制其表达。过表达PeKNOX18的拟南芥植株出现双生果荚,其它表型无明显变化。毛竹木质化过程涉及一个复杂的调控网络,其中有多种转录因子和结构基因的参与。本研究不仅为探究PeHBs在毛竹木质化中的功能研究奠定了基础,而且为全面探究竹材材性形成的分子机制提供了参考依据。