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猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染疾病。自2010年以来,PEDV感染已成为全球养猪业共同关注的问题。及时掌握PEDV流行毒株的分子特征,对指导该病具有重要意义。S基因编码的S蛋白是PEDV的重要结构蛋白,在诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护等方面起关键作用,S基因较易发生变异。本研究对四川2014年PEDV流行毒株的S基因(包括S基因全序列和部分序列)进行克隆、测序和分子特性分析,初步分析了流行株的S基因抗原性(包含COE区的抗原区域)。研究内容如下：(1)四川PEDV流行株S基因的克隆与分子特征分析：以RT-PCR检测了四川14个地区的17个猪场的102份发病仔猪腹泻样本,猪场PEDV阳性率达到100%(17/17),样品PEDV阳性率为88.2%(99/102)。PEDV多为单独感染。根据PEDV-CV777株序列(GenBank登录号：AF353511)设计3对引物扩增完整的S基因,选取2014年四川地区PEDV代表样品扩增了9株S基因全序列和18株S1区(起止位点：1-1389nt),采用RT-PCR扩增S基因、克隆、测序和序列分析。结果表明：S基因S1片段变异较大,18株流行株S1片段全长为1398bp,编码466个氨基酸,存在大量核苷酸的突变、插入及缺失,多以C→T、T→C、 G→T、T→G等突变形式存在。9株完整S基因中,8株全长为4161bp,编码1386个氨基酸,1株为4125bp,编码1374个氨基酸。PEDV四川流行株之间核苷酸序列同源性及氨基酸序列同源性均较高,与SC-L株及CV777疫苗株等的同源性均较低,与2013-2014年US株、Thailand、2014年韩国株等的同源性较高。S基因编码的多肽链具有较好的亲水性,分别含有1个跨膜区域及信号肽切割位点,潜在的磷酸化位点及糖基化位点与CV777差异较大。密码子偏嗜性分析表明S基因对编码的T’rp, Met, His, Asp, Cys氨基酸具有一定的偏嗜性。S蛋白含有多个α螺旋区段、β折叠区段、β转角区域及无规则卷曲区域。遗传进化分析结果表明,本研究中的PEDV四川地区流行毒株均属于同一群,18株四川流行株S1区与中国株CH8、YS、CHGD-01、GDMZ/2013、韩国株CNU-091222-01、美国株USA/Iowa/18984/2013、USA IA2、 USA/Indiana/17846/2013、USA/Kansas125/2014、US A/Texas 128/2014、最新韩国株Korea KUIDL-PED-2014-002及KUIDL-PED-2014-007、泰国株Thailand PPED0108、Thailand 1-55ST0412、Thailand 6-56ST0413、Thailand SBPED0211-2等亲缘关系较近。COE区与S全基因与参考株的亲缘关系与S1区相似,但COE区具有地区性差异,这提示四川境内流行的毒株也在不断进化。此外,研究中所有四川地区PEDV流行毒株均与经典毒株CV777、Brl/87,中国早期流行毒株LZC、SC-L、DX、韩国株Chinju99、DR13及日本株83p-5等亲缘关系较远。(2)S蛋白抗原性的初步分析：本研究设计了包含COE区的部分S蛋白片段(命名为SD蛋白)的特异性引物SD-F、SD-R,用RT-PCR技术扩增了PEDV四川乐山流行株及CV777疫苗株的892bp的抗原表位片段,并插入原核表达载体pET39b(+)中,分别构建了重组表达质粒pET39b-SC-SD及pET39b-Vaccine-SD。将重组表达质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)中,经37℃,lmmol/L IPTG诱导表达4h, SDS-PAGE显示目的基因片段得到表达,目的蛋白分子量约为62kD,表达量较低。将包涵体切胶纯化,以获得的S蛋白抗原免疫家兔获得兔抗多克隆抗体,通过琼脂扩散法测定抗体效价,流行株及疫苗株的效价分别为1：8、1：4,同时对纯化的蛋白进行Western blot检测,表明获得的抗体对原核表达的SD蛋白具有特异性反应。