论文部分内容阅读
目的:收集和整理《中华医典》和《中华大典·医药卫生典》中与失眠、健忘有关的中医古籍,重点阐明失眠健忘同治的中医理论基础及其治则治法,丰富和发展中医药防治失眠、健忘的理论。将5月龄APP/PS1双转基因小鼠作为痴呆伴睡眠障碍模型小鼠,并给予小鼠生慧汤,通过行为学、病理学、分子病理学等现代生物学技术阐明生慧汤对痴呆伴睡眠障碍模型小鼠的干预作用,并分析生慧汤干预痴呆伴睡眠障碍的作用机制,从而为失眠健忘同治提供理论根据和实验依据。方法:1.理论探讨:分析失眠健忘共病的病理特点,并分析二者相似的病因、病机、病位、病性和病势,再此基础上探析失眠健忘同治的机理及其治则治法。2.实验研究:选用5月龄APP/PS1双转基因小鼠和同系背景、同龄的C57BL/6JNju小鼠。将APP/PS1小鼠随机分为模型(Model)组、多奈哌齐(Donepezil)组、生慧汤(Shenghui Decoction,SHD)组,C57BL/6JNju小鼠作为空白(Control)组。分组完成后开始给药,Control组和Model组给予等体积纯水,Donepezil组给予盐酸多奈哌齐片制成的药液,SHD组给予生慧汤制成的药液,连续灌胃4周。应用Morris水迷宫实验和跳台实验评价各组小鼠的学习记忆力;采用自主活动观察各组小鼠睡眠节律的变化;应用尼氏染色、高尔基染色观察各组小鼠海马神经元-突触损伤的情况,应用Brd U免疫组化和免疫荧光双标(Brd U/DCX、Brd U/Neun、Brd U/GFAP)观察各组小鼠海马神经元增殖、分化及神经元的增殖类型;应用LC-MS/MS检测各组小鼠血清神经递质表达水平;应用ELISA检测各组小鼠血清中IL-1β、TNF-α的表达水平;应用Real Time-PCR检测各组小鼠海马中IL-1β、TNF-αm RNA表达水平;应用Western Blot检测各组小鼠海马中IBA1、GFAP、PPARγ、JAK2、JAK3、p-JAK2、p-JAK3、SOCS-1的蛋白表达水平;应用16S r RNA对各组小鼠粪便进行髙通量测序,以明确各组小鼠肠道微生物菌群的差异。结果:1.实验一结果(1)水迷宫实验结果与Control组比较,Model组小鼠平台潜伏期、游泳总路程和第1次抵达平台时间都有增加(P<0.01),而穿越平台次数和目标象限时间都有减少(P<0.01)。与Model组比较,Donepezil组和SHD组小鼠平台潜伏期、游泳总路程和第1次抵达平台时间均有减少(P<0.01,P<0.05),而穿越平台次数和目标象限时间都有所增加(P<0.01,P<0.05)。(2)跳台实验结果与Control组比较,Model组小鼠出错次数明显增加(P<0.01),而潜伏期则明显减少(P<0.01)。与Model组比较,Donepezil组和SHD组小鼠出错次数减少(P<0.01,P<0.05),而潜伏期则有所增加(P<0.01,P<0.05)。(3)小鼠睡眠节律性分析与Control组比较,Model组小鼠光照环境活动时间、黑暗环境活动时间和总活动时间都有明显增加(P<0.01)。与Model组比较,Donepezil组和SHD组小鼠光照环境活动时间、黑暗环境活动时间和总活动时间有不同程度减少(P<0.01,P<0.05)。2.实验二结果(1)尼氏染色结果Control组小鼠海马CA3和DG区神经元形态完整、核仁清晰,胞浆内尼氏体丰富,锥体神经元排列规则,没有明显神经元丢失;Model组小鼠海马CA3和DG区神经元丢失明显,排列紊乱松散,尼氏体数量减少,神经细胞皱缩,染色质凝集成块、核固缩,部分细胞肿胀、破裂,细胞边界不清,排列紊乱,胞浆染色质有明显固缩,尼氏体减少;Donepezil组和SHD组小鼠海马CA3和DG区神经元边缘清晰,神经元仍有少量丢失,仅少量染色质凝集、尼氏体数量增加。与Control组比较,Model组小鼠海马CA3和DG区神经元数目明显减少(P<0.01,P<0.05)。与Model组比较,Donepezil组和SHD组小鼠海马CA3和DG区神经元数目增加(P<0.01,P<0.05),小鼠海马CA1和CA4区神经元数量也有增加,但差异没有统计学意义(P>0.05)。(2)高尔基染色结果与Control组比较,Model组小鼠海马CA3和DG区神经元树突棘密度明显下降(P<0.01,P<0.05)。与Model组比较,Donepezil组和SHD组小鼠海马CA3和DG区神经元树突棘密度均有不同程度增加(P<0.01,P<0.05)。(3)免疫组化实验结果与Control组比较,Model组小鼠海马DG区中Brd U阳性细胞数明显下降(P<0.01,P<0.05)。与Model组比较,SHD组小鼠海马DG区Brd U阳性细胞数均有不同程度增加(P<0.05)。(4)免疫荧光实验结果与Control组比较,Model组小鼠海马DG区Brd U/DCX、Brd U/Neu N、Brd U/GFAP阳性细胞数明显下降(P<0.01,P<0.05)。与Model组比较和SHD组小鼠海马DG区Brd U/DCX、Brd U/Neu N、Brd U/GFAP阳性细胞数均有不同程度增加(P<0.05),Donepezil组小鼠海马DG区Brd U/DCX、Brd U/Neu N、Brd U/GFAP阳性细胞数均有所增加,但差异没有统计学意义(P>0.05)。3.实验三结果Ach、Ch AT结果:与Control组比较,Model组小鼠血清中Ach、Ch AT的表达量明显降低(P<0.01)。与Model组比较,Donepezil组和SZRD组小鼠血清中Ach、Ch AT的表达量有不同程度升高(P<0.01,P<0.05)。NE、E结果:与Control组比较,Model组小鼠血清中NE的表达量明显降低(P<0.01)。与Model组比较,SHD组小鼠血清中NE的表达量有不同程度升高(P<0.01),而Donepezil组小鼠血清中NE的表达量变化不明显,差异没有统计学意义(P>0.05)。Glu、5-HIAA和DA结果:与Control组比较,Model组小鼠血清中Glu的表达量明显升高,与Model组比较(P<0.01),SHD组小鼠血清中Glu的表达量有不同程度降低(P<0.05),而Donepezil组小鼠血清中Glu的表达量变化不明显,差异没有统计学意义(P>0.05)。与Control组比较,Model组小鼠血清中5-HIAA、DA的表达量明显降低,与Model组比较,SHD组小鼠血清中5-HIAA、DA的表达量有不同程度升高(P<0.05),而Donepezil组小鼠血清中5-HIAA、DA的表达量变化不明显,且差异没有统计学意义(P>0.05)。4.实验四结果(1)ELISA实验结果与Control组比较,Model组小鼠血清中TNF-α、IL-1β都有明显升高(P<0.01),与Model组比较,Donepezil组和SHD组小鼠血清中TNF-α、IL-1β有不同程度降低(P<0.01,P<0.05)。(2)Real Time-PCR实验结果与Control组比较,Model组小鼠海马中TNF-α、IL-1βm RNA都有明显升高(P<0.01),与Model组比较,Donepezil组和SHD组小鼠海马中TNF-α、IL-1βm RNA有不同程度升高(P<0.01,P<0.05)。(3)Western Blot实验结果与Control组比较,Model组小鼠海马中IBA1和GFAP蛋白表达水平都有明显升高(P<0.01),而PPARγ的蛋白表达水平都有明显降低(P<0.01)。与Model组比较,Donepezil组和SHD组小鼠海马中IBA1和GFAP蛋白蛋白表达水平有不同程度下降(P<0.01,P<0.05),而PPARγ的蛋白表达水平也有升高(P<0.05)。与Control组比较,Model组小鼠海马中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3和SOCS-1的蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。与Model组比较,Donepezil组和SHD组小鼠海马中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3和SOCS-1的蛋白表达水平下降(P<0.01,P<0.05)。5.实验五结果(1)小鼠肠道菌群Alpha多样性检测结果与Control组比较,Model组小鼠肠道Chao1指数、ACE指数、Simpson指数和Shannon指数均有下降(P<0.01,P<0.05)。与Model组比较,Donepezil组和SHD组小鼠肠道Chao1指数、ACE指数、Simpson指数和Shannon指数均有不同程度升高(P<0.01,P<0.05),这说明APP/PS1痴呆小鼠肠道菌群的丰富度多样性下降,而生慧汤则可以提高痴呆小鼠肠道菌群丰富度和多样性。(2)小鼠肠道菌群分类水平差异物种比较门水平上,与Control组比较,Model组中Firmicutes(厚壁菌门)和Actinobacteria(反线菌门)下调(P<0.05)。与Model组比较,Donepezil组和SHD组中Firmicutes(厚壁菌门)和Actinobacteria(反线菌门)上调(P<0.05)。纲水平上,与Control组比较,Model组中Epsilonproteobacteria(ε-变形菌纲)下调(P<0.05)。与Model组比较,Donepezil组和SHD组中Epsilonproteobacteria(ε-变形菌纲)上调(P<0.01,P<0.05)。目水平上,与Control组比较,Model组中Lactobacillales(乳酸杆菌目)和Bifidobacteriales(双歧杆菌目)下调(P<0.05)。与Model组比较,Donepezil组和SHD组中Lactobacillales(乳酸杆菌目)和Bifidobacteriales(双歧杆菌目)上调(P<0.01,P<0.05)。科水平上,与Control组比较,Model组中Lactobacillaceae(乳酸杆菌科)和Bacteroidaceae(拟杆菌科)下调(P<0.05)。与Model组比较,Donepezil组、SHD组中Lactobacillaceae(乳酸杆菌科)和Bacteroidaceae(拟杆菌科)上调(P<0.01,P<0.05)。属水平上,与Control组比较,Model组中Lactobacillus(乳杆菌属)和Bacteroides(拟杆菌属)下调(P<0.05),与Model组比较,Donepezil组和SHD组中Lactobacillus(乳杆菌属)和Bacteroides(拟杆菌属)上调(P<0.01,P<0.05)。结论:(1)失眠、健忘具有相同病因、病机及病理特点,可用补肾调心健脾法防治失眠健忘;(2)生慧汤能改善APP/PS1小鼠的学习记忆力和睡眠障碍;(3)生慧汤能改善APP/PS1小鼠的神经元-突触损伤,二者可不同程度促进APP/PS1小鼠海马神经发生;(4)生慧汤可以调节APP/PS1小鼠血清中神经递质水平;(5)生慧汤可以通过抑制海马神经炎症改善海马神经发生微环境,其机制可能与其调节PPAR-γ/JAK2/STAT3/SOCS-1信号通路有关;(6)生慧汤可以改善APP/PS1小鼠肠道微生物丰富度和多样性,并能调节肠道中与Ach、γ-GABA、5-HA和DA等神经递质有关菌群。