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目前血小板需求量大，而来源紧张及潜在的血液传播疾病使得血小板的临床应用面临严峻挑战，为寻找更为安全充足的血小板替代品，许多研究人员将目光投向干细胞体外定向诱导分化技术。然而目前体外诱导生成巨核系细胞及血小板仍有很多技术问题亟需解决，并且体外分化的分子调控机制尚不十分清楚，因此本研究拟以脐带血造血干/祖细胞为起始细胞，体外诱导其向巨核细胞分化，并在此过程中首先对诱导培养体系进行优化，进而选取在巨核系分化过程中表达量呈现特异性变化的一种miRNA，即miR-125b，深入分析miR-125b对巨核系分化影响，并对此过程中的分子机制进行深入探讨。本课题共分为三个部分：第一部分：脐带血造血干/祖细胞向巨核细胞分化体系的建立与优化方法：首先建立以间充质干细胞为基质细胞的巨核系诱导体系。分离得到骨髓和脐带两种来源的间充质干细胞，并对两种来源的间充质干细胞进行表面标志和多向分化能力的鉴定，同时通过实时定量PCR和对RT-PCR产物的电泳分析，对比相同培养代数下两种间充质干细胞表达造血因子的情况。用梯度离心法分离得到单个核细胞，通过直接接触或Trans-well分隔的方式分别与间充质干细胞共培养，观察细胞增殖情况，并检测巨核系特异性的表面标志和相关基因及某些miRNA的表达量。同时优化了无基质细胞培养体系，对比两种不同基础培养基Xvivo-15和Stemspan对巨核系分化的影响。结果：骨髓和脐带来源的间充质干细胞均分泌对巨核细胞增殖和分化有促进作用的造血因子，与造血干/祖细胞直接共培养，对于巨核细胞的增殖有明显的促进作用，但分化效果不明显；在非接触共培养的条件下，对巨核细胞的增殖及分化都产生明显的促进作用，且骨髓来源的间充质干细胞较脐带来源的效果更显著；在对比不同共培养方式对巨核系分化的影响的同时，发现miR-125b的表达量与细胞向巨核系分化的程度成正比，以此推测miR-125b可能参与到MNC向巨核系分化的过程中。第二部分：miR-125b促进造血干/祖细胞向巨核细胞分化及其作用机制方法：在造血干/祖细胞向巨核系分化的过程中选取不同的时间点以及不同成熟程度的细胞群，对其中miR-125b的表达情况进行检测，观察在巨核系分化过程中miR-125b的内源性变化趋势，并通过瞬时转染的方式，在MNC中外源性过表达或下调表达miR-125b后，在巨核诱导培养基中进行诱导分化，观察细胞的与巨核系分化相关的生物学特性的改变，同时利用红白血病细胞K562的巨核系分化模型，建立并筛选出能够稳定过表达miR-125b的K562细胞，进行巨核诱导，观察在此过程中miR-125b对K562细胞向巨核细胞分化的影响。结果：在MNC向巨核系分化过程中，miR-125b的表达量呈现出先轻微下降再明显升高的变化趋势，并在成熟的巨核细胞和血小板中大量表达；通过转染的方式，能够外源性改变miR-125b的表达量，并且过表达miR-125b对巨核系分化有明显促进作用，而下调miR-125b的表达则会明显抑制该过程的发生，在稳定过表达miR-125b的K562细胞中也观察到miR-125b对巨核系分化的明显的促进作用，与原代细胞中的结果一致。由此推断miR-125b参与造血干/祖细胞向巨核细胞分化，并且在这个过程中起到了促进的作用。第三部分参与巨核系分化的miR-125b靶基因的确定和验证。方法：通过生物信息学预测和相关文献调研，选取若干miR-125b的靶基因进行检测，并最终着眼于细胞周期相关基因p19INK4D。观察miR-125b对靶基因p19INK4D的作用，检测在巨核系分化过程中p19INK4D的内源性表达变化，并且在K562和UT-7两种人白血病细胞系中外源性直接下调表达p19INK4D验证其对细胞增殖和巨核系分化的影响。结果：通过荧光素酶报告实验及实时定量PCR、westernblot等实验证实，miR-125b可以通过不完全互补配对的方式结合在p19INK4D的3’UTR，并且在mRNA和蛋白水平下调p19INK4D的表达，p19INK4D在巨核系分化过程中的表达变化与miR-125b的变化相对应；而且p19INK4D的下调表达可以促进细胞向巨核系分化。因此我们有理由得出如下结论miR-125b通过下调p19INK4D来促进造血干/祖细胞向巨核系分化。本实验基于实验室以往的工作基础，通过尝试与间充质干细胞以不同方式共培养和对于无基质细胞培养体系的基础培养基的对比，为今后进一步优化巨核系诱导分化体系奠定了基础，并对未来体外大规模制备巨核系祖细胞应用于临床治疗有一定的指导作用。而在这一基础上观察到miR-125b的特异性表达变化趋势，并由此进一步关注miR-125b在巨核系分化过程中的表达变化，通过外源性改变miR-125b的表达量观察对巨核系分化的影响，确定miR-125b促进巨核系分化的作用，并对其机制进行探讨，深入阐释了miRNA在调控巨核系分化中的作用和机理，为进一步调控造血干/祖细胞来更高效获取成熟的巨核细胞提供了理论依据。